CHAPTER_2_DNA凝胶电泳.pptVIP

pulsed-field gel electrophoresis 1. 配制足量的电泳缓冲液，用以灌满电泳槽和配制凝胶。 2. 根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖溶液：准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角瓶中。 3. 在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。 4. 转移三角瓶冷却到55℃左右，加入溴化乙锭，终浓度为0.5μg/ml ，轻轻混匀。 5. 琼脂糖正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在托盘底面0.5-1.0mm，琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。 6. 浇灌琼脂糖凝胶溶液，厚度3-5mm 7. 让凝胶溶液完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放到电泳槽内。 8. 向电泳槽内加入电泳缓冲液，刚好要没过凝胶1mm。 9. 混合DNA样品和0.2倍体积的6×载样缓冲液。 10. 用微量移液器及一次性吸头将样品缓慢加入凝胶内的加样孔内。此外，在另外一个加样孔内加入分子质量标准。 11. 盖上电泳槽，接好电极插头，加上5V/cm的电压，DNA应向正极泳动，待溴酚蓝迁移到适当距离后停止电泳。 12. 关上电源，拔出电极插头，打开电泳槽盖。若凝胶中有溴化乙锭，即可用紫外灯观察或照相；若无溴化乙锭，则需用溴化乙锭溶液浸染30-45min后照相。 DNA marker 1.5ml含0.3 mol/L NaCl的TE (pH 7.6)洗柱2次。 0.5ml含0.6 mol/L NaCl的TE（pH 7.6） 洗脱DNA，共3次。 用酚氯仿抽提洗脱液1次。 将水相等体积的分装在两个微量离心管中，每管加等体积的异丙醇，室温放置15min，于4℃离心10min，回收DNA。 用70%的乙醇清洗沉淀，让乙醇挥发，将沉淀溶于TE中。 阴离子交换色谱纯化回收DNA 有机溶剂抽提法（低熔点琼脂糖凝胶） 方法： 1. 用1×TAE电泳缓冲液灌制一块含有适当浓度的低熔点琼脂糖凝胶。（EB可在灌制凝胶前加入，也可在电泳结束后染色） 2. 待凝胶冷却至室温后，将凝胶连同支撑用的塑料板一起放入电泳槽中。 3. 将DNA样品与载样缓冲液混合，注入到加样孔中，进行电泳。 有机溶剂抽提法（低熔点琼脂糖凝胶） 4. 用紫外灯确定目的条带的确切位置。 5. 用刀片切下含有目的条带的琼脂糖凝胶切片，转移至一个干净的离心管中。 6. 加约5倍体积的LMT洗脱缓冲液至离心管中，盖好管盖，65℃温育5min熔化凝胶。 7. 待凝胶冷却至室温后，加等体积的平衡酚，轻轻混匀，离心10min，回收水相。 8. 再用等体积的酚氯仿、氯仿各抽提一次。 有机溶剂抽提法（低熔点琼脂糖凝胶） 9. 水相转移至另一新的离心管中。加0.2倍体积的10mol/L 乙酸铵和2倍体积4℃的无水乙醇。混合液在室温下放置10min。然后4℃离心20min，沉淀回收DNA。 10. 用70%乙醇清洗沉淀，并溶于适当体积的TE中备用。 （此法适用广泛，如需更高纯度的DNA，可经此方法回收后再经过DEAE-Sephacel层析法进行纯化） 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶由丙烯酰胺、N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺(TEMED)、N,N’-亚甲双丙烯酰胺、过硫酸铵反应组成。 方法： 安装电泳装置和配制凝胶溶液 聚丙烯酰胺凝胶电泳 安装电泳装置和配制凝胶溶液 1. 必要时可用KOH/甲醇清洗玻璃板和间隔片。 2. 用温热的去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片，再充分漂洗，先用自来水，再用去离子水，避免油污污染，晾干。 3. 可选择用硅化液（Sigmacote或Acrylease）处理玻璃片，然后再用去离子水冲洗干净。（防止凝胶与玻璃板粘附，以免在拆卸时凝胶发生断裂） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 安装玻璃片与间隔片 将两块玻璃片（不带凹口和带凹口）平行放置在一起，用夹子夹紧。检查两边和底部，形成不漏水或透水的密封。 5. 根据玻璃板的大小和间隔片的厚度计算所需凝胶，配制适当体积的凝胶，避免有气泡产生。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 灌制凝胶 6.配制凝胶溶液：戴上手套，在托盘上操作，动作应迅速。 （1）每100ml 丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液加入35 μl TEMED,轻轻混匀。 （2）用50ml 注射器吸取凝胶溶液，排净空气，将注射器针头插入两块玻璃板之间的空隙，注入丙烯酰胺溶液。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 7. 立即将合适的梳子插入到凝胶中，小心勿使梳齿留下气泡。 8. 丙烯酰胺于室温聚合30-60min，如凝胶回缩明显，应补加溶液。 9. 聚合完全后，在梳子的周围及顶部喷些1×TBE溶液，从聚合的凝胶中小心取出梳子，用1×TBE溶液冲洗加样孔。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 上样与电泳 10. 将凝胶放入垂直电泳槽中，用夹子固定好凝胶，带凹口的玻璃板向里放