DNA的酶切、回收和连接转化.pptVIP

第四部分 ＤＮＡ重组技术 －－ＤＮＡ的酶切、回收和连接转化 ＤＮＡ的酶切反应 　分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。它能识别双链ＤＮＡ分子中特定的靶序列（4～8bp),并在该序列内切断ＤＮＡ，形成特有的粘末端或平端。 一、实验目的 掌握ＤＮＡ酶切的基本原理。 学习和了解限制性内切酶的使用方法。 学习和掌握ＤＮＡ片段胶回收的方法 二、实验原理 1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链ＤＮＡ中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段5’端为P，3’端为OH。由于限制性内切酶能识别ＤＮＡ特异序列并进行切割，因而在基因重组、ＤＮＡ序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。 三、试剂与器材 ?（一）试剂 限制性内切酶；10×内切酶缓冲液 T4ＤＮＡ连接酶；10×连接酶缓冲液 电泳缓冲液　1×TAE 琼脂糖；溴酚兰； 溴化乙锭(工作浓度0.5μg/ml) 酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水 （二）实验器材 1．电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄影设备 2．恒温水浴槽 四. 操作步骤 酶切反应 1.设计酶切体积为20~30μl，计算清楚酶切系统中 各成分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下 进行多个酶切反应，建议统一加好共同的组分后， 分装； 2.先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积 的10x酶切缓冲液，混匀； 3.在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶； 4.加入适量的ＤＮＡ样品； 5.弹匀，短暂离心； 6.置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切1~3小时，酶切 过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的 酶切体系各组分浓度改变过大; 7.置65℃水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶 灭活条件可能不同，请参照说明书进行; 8.进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果; 9.反应体系： 10×内切酶缓冲液 2?l ＤＮＡ 1-1.5?g 限制性内切酶 2-5单位 用灭菌的ddH2O补至20?l，37℃ 1小时。可根据需要按 比例放大。 五.注意事项 影响限制性内切酶活性的生物因子： 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质； 识别序列在ＤＮＡ中的分布频率； 与ＤＮＡ的构象有关（SC,L,OC）； ＤＮＡ的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）； 内切酶用量不超过总反应体积的10%； 消化时间适当延长有利于提高酶活性； 加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性的作用； 用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性； 酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用； ＤＮＡ样品应不含重金属离子 ＤＮＡ片段的胶回收 电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行） 胶回收后用30-50 μl无菌双蒸水洗脱ＤＮＡ片段，取1-5 μl进行电泳检测，取2-5 μl测定OD260下的光吸收值，计算ＤＮＡ的浓度。 注：1 OD 260相当于双链ＤＮＡ浓度为50 μg /ml 胶回收注意事项 将电泳槽用ddH2O反复清洗干净, 倒入新鲜配制的灭菌电极缓冲液； 根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板； 切胶时尽可能切掉不含ＤＮＡ片段的凝胶； 要尽量减少ＤＮＡ在紫外下的照射时间以减少对ＤＮＡ的损伤； 熔胶要完全 。 ＤＮＡ的连接 在T4ＤＮＡ连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的ＤＮＡ分子可以连接上。ＤＮＡ连接酶的作分三步： T4ＤＮＡ 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。 酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟基切口的ＤＮＡ分子上，使ＤＮＡ腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。 1、ＤＮＡ分子的体外连接 ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。 连接反应中值得注意的几个问题： 1.ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自