MTT法小结-目的和意义.pptVIP

MTT法小结 MTT法目的和意义 检测细胞存活和生长情况 用于评价细胞毒作用 原理 四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。 活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。 在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。 微生物污染可导致本法假阳性结果 MTT的配制 MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。 配制MTT时用PBSph=7.4溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。 贴壁细胞操作步骤 1.??接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100ul。 （边缘孔用无菌PBS填充）。 2.??培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药100ul，一般设5个复孔。 3. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6. 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）  悬浮细胞操作步骤： 1）调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照。 2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后直接测），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 注意事项 1．?选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2．??避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。3．??设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。 实验前应明确的问题 1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）