利用定点突变技术改良菌株.pptVIP

定点突变技术在菌株改造中的利用 1、定点突变技术2、菌株改造实例 定点突变技术 概念 ： 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。 定点突变技术 分类： 盒式诱变、寡核苷酸引物诱变、PCR诱变 菌株改造实例 Subunit and cofactor binding of Saccharomyces cerevisiae sulfite reductase – towards developing wine yeast with lowered ability to produce hydrogen sulfide 菌株改造实例 同其他工业发酵用的酵母一样，酿酒酵母在发酵过程中也会产生硫化氢。这次工作的主要目的是通过降低NADPH依赖的亚硫酸盐还原酶（一种在含硫氨基酸的合成中起关键作用的酶）的活性来减少硫化氢的产生。实验讨论了酿酒酵母菌株的改良 菌株改造实例 背景： 酿酒酵母在发酵过程中产生硫化氢是在工业生产酿制葡萄酒中的常见问题。硫化氢在味觉上拥有一个极低的阈值，在一升酒中，50-80微克的硫化氢就会引起带有硫磺的味道的不良口感。 主要利用的菌株是S. cerevisia 。该酵母中的NADPH依赖的亚硫酸盐还原酶是一个由2个α和2个β亚基组成的复合物。α亚基由met10基因编码，Met5编码β亚基。 菌株改造实例 实验方法： 建立Met 10p三维结构模型 定点突变MET 10和蛋白的表达 测定亚硫酸盐的累积 酵母双杂交系统 菌株改造实例 采用Stratagene公司的寡核苷酸突变技术来突变MET10基因，使得氨基酸发生改变。以纯化的质粒DNA（至pGEM - MET10）（5-50纳克）作为定点突变的模板。引物的设计包括设计包括的突变和质粒上的互补序列。通过测序确定序列正确。诱变率为75%-100%。用来连接MET10的质粒为pRS425 (ATCC 77106) 2μm的高拷贝数的酵母LEU2穿梭载体。在诱导MET3启动子的前面，克隆MET10和met10等位基因到这个载体上。 菌株改造实例 菌株改造实例 谢谢~ * * 1. 盒式诱变（cassette mutagenesis） 利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列获得数量众多的突变体。 2. 寡核苷酸引物诱变 用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动单链DNA分子发生复制，这段引物成为新合成的DNA子链的一部分，产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列。 定点突变技术 3．PCR诱变 寡核苷酸引物诱变法缺点：诱变仅限于靶DNA区段的5’末端。当对靶DNA的中心部位进行诱变时，需要PCR定点诱变法。 （1）重组PCR定点诱变法 （2）大引物诱变法 PCR诱变——目的突变体的效率可达100％ 缺点： PCR产物需连接到载体上，才能对突变基因进行转录等方面的研究；Taq DNA聚合酶拷贝DNA的保真性必须经过核苷酸序列测定。 定点突变技术 重组 PCR 定点诱变法 根据靶DNA序列设计一对互补内侧引物A和A’，它们在相同部位具有相同碱基突变。 分别以左侧引物A和右侧引物A’进行两轮PCR扩增。 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，变性后可退火形成异源双链分子。 只有具有3’凹陷末端的双链分子，可通过Taq DNA聚合酶以及外侧引物B和C的作用下，形成突变位点位于靶序列中间的突变体。 4种引物 3轮PCR 以第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的大引物。步骤得到简化，只需三种扩增引物获得突变体DNA。 3种引物 2轮PCR 大引物诱变法 小结： 构建一个可以降低亚硫酸盐还原酶活力的葡萄酒酵母，就有可能降低在发酵过程中硫化氢的产量。利用定点突变使NADPH和FAD结合位点氨基酸残基在发生改变，改变酿酒酵母met10p和met10基因表达。本研究发现了MET5和MET10这两个基因之间的相互作用。只有在缺乏甲硫氨酸的情况下这两个基因相互作用 。