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实验五 细胞克隆化培养技术— 有限稀释法 一、实验目的 1、掌握用有限稀释法进行细胞克 隆化培养技术； 2、学会细胞克隆形成的分辩观察技术。 二、实验原理 克隆化培养即单细胞培养技术，用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化培养，可以及时确定阳性杂交瘤细胞株，同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的轻、重链基因分离而出现无抗体分泌阴性细胞株。 一般杂交瘤细胞需经过2—3次反复克隆后，才能达到100%细胞阳性率。 该办法亦适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择，识别和分离。是细胞株的常用方法。 三、实验材料 1、仪器与用品：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、灭菌高压锅、96孔细胞培养板、15ml离心管、10ml移液管、1ml滴管、吸管、血球计数板。 2、材料：、饲养细胞、杂交瘤细胞。 3、试剂：DMEM培养基、小牛血清。 四、实验步骤 1、分装了每孔0.1毫升腹腔细胞的96孔细胞培养板（可提前24小时准备就绪，置CO2培养箱中备用）； 2、自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞（亦可自24孔培养板孔中收集），制成悬液； 3、按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在105/毫升左右； 四、实验步骤 4、取3支10毫升刻度离心管排列在超净工 作台试管架上，先用无血清培养基将细胞稀释至103/毫升，再用含15%小牛血清的完全培养基稀释到101/毫升细胞，即每0.1毫升1个细胞； 5、每孔0.1毫升细胞悬液； 6、置37℃5%CO2培养箱，4天后取出观 察，并在板盖上打上标记，做好记录并统计结果； 四、实验步骤 7、继续培养时，则在第4-5天更换1/2培养基，约第7-9天可以收获培养液上清用于检测抗体。并重复检测1-2次； 8、选择单克隆生长孔，生长良好，阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。 五、实验结果 实验结果以总细胞孔（如96孔）中出现克隆孔统计出克隆百分率，并可进一步按单细胞孔、双细胞孔、多细胞孔分别计算出百分率。 注意事项 1、注意无菌操作，一旦发现污染（孔）必须及时处理； 2、计数细胞要求准确，稀释量亦要准确，否则将造成一孔多细胞克隆或克隆百分离太低； 3、在计数克隆出现率之前，不宜更换培养液，也不宜强烈振动培养板； 4、做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清； 5、若做克隆抗体检测时，特别要保护细胞的生长状况，防止细胞生长不良甚至丢失。 * * 返回 返回
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