胰酶EDTA消化贴壁细胞.pptVIP

贴壁细胞: 在体外培养条件下，必须贴附于支 持物表面才能生长的细胞。如CHO细胞。 消化：使经过分散的组织或贴壁的培养物相互或与介质解离，形成单细胞或小的细胞团的操作。 细胞冻存: 细胞保存的主要方法之一。 利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中 低温保存，使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。 细胞复苏：将冻存的细胞解冻，再进行传代培养。 要获得好的冻存与复苏效果，必须了解以下几个问题： 冷冻速率 复温速率 冷冻保护剂 冷冻保存温度 1、 冷冻速率 冷冻速率是指降温的速度，是活细胞能否被冷冻到一个能永久保存的温度的一个主要因素。冷冻速率太快或太慢都会造成细胞的损伤，只有以最适的冷冻速率冷冻细胞，才能获得最佳的冷冻保存效果。 2、复温速率 复温速率是指细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存的细胞复苏时，复温速率不当也会降低冷冻存活率。一般来说复温速度越快越好，37℃水浴中，1～2分钟内要完成复温。 3、冷冻保护剂 　冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，常被加到一定的溶液中进行配制，作为冷冻保护液。 　 常用的冷冻保护剂 ：ＤＭＳＯ 4、冷冻保存温度 冷冻保存温度是指能长久保存细胞的一个深低温度。在这样的温度下，细胞生化反应极其缓慢或停止，但经长期保存和复苏后仍能保持正常的结构和功能。从实际和效益的观点出发，液氮温度（﹣196℃）是目前最佳冷冻保存温度 　ＤＭＳＯ：是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤 。 　ＤＭＳＯ的浓度必须=10%,大于这个浓度即使在低温对细胞也有毒性作用。有些细胞不能用DMSO，可用甘油。 细胞冻存程序 1．细胞冻存前24-48小时传代培养，使细胞处于 指数生长期 ． 2．经胰酶消化后，加入适量培养基，吹打成细胞 悬液． 3．加入新生牛血清． 4．加入经过除菌过滤的ＤＭＳＯ． 5．混匀 6．将悬液加入灭菌冻管中，1-2 ml/支，严密封口后，注明细胞名称 ． 7．置4度冰箱中，30分钟后转入-20度冰箱中，30分钟后转入液氮口，４小时后转入液氮中保存． 8.复苏一支细胞，检测细胞活力及有无污染 细胞复苏程序 取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化 直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基 . 24小时细胞贴壁后换液. 注意: 1) 冻存可用10%-90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力 . 2) 细胞在-15度左右胞内形成结晶对细胞损伤最大，缓慢降温有助于减少损伤，故放入-20度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便，保存时间过久会影响细胞活力 谢谢 贴壁细胞的消化处理及注意事项 贴壁细胞的消化 贴壁细胞在培养瓶中长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，扩增、传代 。 贴壁较紧的细胞如Hela，HepG2，CHO等，则需要以细胞消化液消化后，才能脱落和分散，扩瓶 。常用的消化液为胰蛋白酶，EDTA等 主要消化方式 一、酶消化法 ( 胰酶Trypsin ) 二、离子螯合剂 ( EDTA ) 一、酶消化法 ( 胰酶Trypsin ) 1 ) 胰酶消化原理: 胰酶是一种蛋白酶。通过在特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养皿壁结合处蛋白降解，使两者分离。这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力作用下成为球形。 细胞消化用胰蛋白酶常用的工作浓度为0.25％，pH为7.2-7.4之间。 2) 酶消化法操作过程：（以下操作均必须严格按无菌操作的要求进行）  将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去； ? 加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润；? ? 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为点状透明（出现细小空隙）时，弃去胰酶，并加入适量的有血清培养液终止消化，吹打分散。 图示： CHO贴壁细胞 经过48小时培养 成为致密单层 加入0.25%胰酶后 细胞逐渐皱缩变圆， 细胞间隙增大不再致密 细胞明显皱缩变小， 细胞间隙增大不再致密， 部分细胞维持正常形态， 部分细胞皱缩变圆。 细胞基本皱缩变圆 此时细胞吹打可下 细胞完全皱缩变圆 此时应弃去胰酶， 加入培养基后轻摇 可将细胞从细胞瓶 壁上洗下，将细胞 悬液用吸管吹散后 传代 有