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植物DNA提取 植物DNA提取方法简介 一、植物总DNA提取的基本原理 二、植物总DNA提取方法概述 三、 DNA提取过程中的注意事项 核DNA分子呈不对称的线状结构。高等植物核DNA的分子量为1012左右，长度约109bp。在分离纯化过程中，DNA分子的降解是很难避免的，因而分离纯化所得到的只不过是植物核DNA分子的片段。用于Southern杂交的植物DNA样品在长度上应不小于50Kb。 线粒体DNA和叶绿体DNA分子要小得多，分子量约为107，且为环状结构。 植物总DNA的提取是在破碎细胞时加入去污剂等试剂使核蛋白体解析，然后或是使蛋白质变性沉淀，抽提DNA，或是使DNA沉淀进入固相而与液相中的蛋白质、多糖等杂质分离。RNA的去除主要采用RNase消化，最后用乙醇或异丙醇沉淀DNA。 二、植物总DNA提取传统方法概述 CTAB法 SDS法 CTAB法原理： CTAB（cetyltriethylammonium bromide）十六烷基三乙基溴化铵是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。 SDS法原理： 利用高浓度的SDS，在较高温度（55~65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 提取植物总DNA的流程： ⑴ 取50~100mg新鲜幼嫩的植物材料，于液氮中研磨成粉。（清洗、干燥） ⑵ 将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入一定体积 65℃预热的提取缓冲液，充分混匀，65℃保温10~20分 钟，其间不时摇动。 ⑶ 加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，静止片刻，室温下，12000rpm离心10分钟。 三、DNA提取过程中的注意事项 取材过程中剪子和镊子要及时处理，避免交叉污染。 提取过程中所用到的枪头、Ep管及研钵都要 事先灭菌烘干。 CTAB为白色粉末，有毒，易吸入刺激呼吸道，故配制时一定要戴好口罩和手套。 CTAB溶液在15℃以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液离心和其它操作时不能在低温下进行。 转移DNA溶液用的枪头要剪去尖部，以避免对DNA的机械损伤。 所得DNA沉淀应为白色或灰白色，若呈褐色则有多酚物质污染。 吹干沉淀时，不能吹得太干，太干会使DNA断裂，也可不采用真空抽干，将离心管置于通风柜或超净工作台中令乙醇自然蒸干。 * 生命科学学院 * Extraction of Plants DNA 植物总DNA包括核DNA和核外DNA （1）2×CTAB提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%（W/V）CTAB，40mmol/L巯基乙醇。 （2）10% CTAB：10%CTAB，0.7mol/L NaCl。 （3）氯仿：异戊醇＝24：1 注：CTAB有毒。 CTAB法中所用试剂： （1）提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl（pH8.0），50mmol/L EDTA（pH8.0）， 0.5mol/L NaCl，10mmol/L巯基乙醇。 （2）10%或20%SDS。 （3）5mol/L KAc。 SDS法中所用试剂： ⑷ 将上清液转入另一离心管中，向管中加入1/100体积的RNase A溶液，置37℃20-30min。加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下，12000rpm离心10分钟。（可以重复2~3次） ⑸ 将上清转入另一离心管中，加入1倍体积的异丙醇或2倍体积的95%乙醇，混匀，室温下放置30分钟，观察沉淀生成。 ⑹ 8000rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀用70%乙醇洗涤，吹干，溶于TE或去离子水中备用。 用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm下 的读数。 样品浓度（μg/mL）= OD260×稀释倍数×50 对于DNA纯制品，其OD260/OD280≈ 1.8，OD260/OD230应大于2。OD260/OD280 1.8 说明有RNA污染；OD260/OD2801.8说明有蛋白污染。 DNA浓度及纯度的测定 ： 用琼脂糖凝胶电泳（0.8%）检测核DNA的完整性。 植物材料表面或内部含有较多水分的时候，液氮冷冻会形成冰晶而妨碍研磨。 研磨使用的器皿要在液氮中预冷，研磨的全过程均应在冷冻状态下进