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质粒DNA的酶切鉴定 　　　限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。其特异性地结合于一段特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘性末端的DNA。 实验原理 限制性内切酶切割DNA Construction of pGEM-xy1 Primer of PCR: PAP 5 GACCACGCGTATCGATGTCGAC mA5 5 GGCCAGGAGATTGAACTCAAG B: A: C: Mouse cells X-gene cDNA Ligation Ampr f1 ori pGEM-T Easy Vector(3015 bp) T T LacZ Apa I Sph I Nco I Not I EcoR I Spe I EcoR I Not I Pst I Sac I Ampr f1 ori pGEM- mA1-5R (3204 bp) LacZ Spe I EcoR I Not I Pst I Sac I 189 bp Apa I Sph I Nco I Not I EcoRI T7 pGEM-xy1 mA5 PAP 189 bp Strategy of construction D: Identify positive clone The product of PCR Sample M 189 bp Sample/EcoRI M 189 bp 3015 bp 3204 bp 在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物： 反应物 体积（μl） 质粒DNA 10 10×Buffer 2 RNase 1 EcoR I 0.5 ddH2O 6.5 总计 20 实验方案 注意采用混合配样 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是 电泳。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯 酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直 的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效 果，所以分离效率很高。 核酸电泳 (一) 琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素： 1. 核酸分子大小 迁移率与分子量对数成反比。 2. 胶浓度: 迁移率与胶浓度成反比。 3. DNA 的构象: 一般条件下迁移率: 超螺旋DNA 线形DNA开环DNA 4. 电压: 一般不大于5V/cm。在适当的电压差时，迁移率 与电流大小成正比。 5. 碱基组成: 有一定影响，但影响不大。 6. 温度： 4~30℃都可，常在室温。 电泳时，在胶中加人荧光染料如溴化乙锭(EB)，EB 为扁平分子，很易插入DNA中的碱基对之间。DNA与 EB结合后，紫外光照射时可发射出红橙色可见荧光。 Eb可引起移码突变。 溴化乙锭 吖啶橙 放射菌素D DNA鉴定的三种荧光染料及与DNA的相互作用 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。常用垂直板电泳。单体丙 烯酰胺在加入交联剂后，就成聚丙烯酰胺。由于这 种凝胶的孔径比琼脂糖凝胶的要小，所以可用于分 析分子量小于1000 bp的DNA片段。聚丙烯酰胺中一 般不含有RNase，所以可用于RNA的分析。但仍要留 心缓冲液及其他器皿中所带的RNase。 聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经啡啶溴红染色， 在紫外光照射下，发出的荧光很弱，所以浓度很低 的核酸样品不能用此法检测出 注意事项 直接在抽提的质粒DNA管中加入酶切体系。 为使微量操作更精确，可以4个人（8 tubes）一起做9 份酶切 体系混合液，然后再分装10ul于各质粒管中。 上样时要小心操作，防止样品溢出。 接触凝胶时，因其中含有EB，要戴手套，废物丢弃要 在固定位置。 5. EB是极强致癌物！小心！ 思考题 1、影响限制性酶切的因素有哪些？ 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 3、如何设置酶切反应的对照？