第3章基因克隆载体.pptVIP

第三章 基因克隆载体 基因克隆载体的特点 具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点． 进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与染色体整合在一起． 在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合的受体细胞染色体DNA一起复制． 外源基因能在受体细胞中表达． 克隆载体进入细胞后有可供选择标记． ２ 克隆载体的分类 质粒载体 大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体，酵母质粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体 噬菌体质粒载体 双链DNA噬菌体载体：λ 单链DNA噬菌体载体：M13，T3，T7 病毒载体 植物病毒载体CaMV（花椰菜花斑病病毒） 动物病毒载体 SV40（猿猴空泡病毒） 质粒和噬菌体DNA兼有的载体 　Phasmid 载体（含有f1 噬菌体的ori） 　 Cosmid 载体（含有λDNA的Cos区） 染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 　 基因整合平台系统 　ＹＡＣ克隆载体 其它克隆载体 2.2 按克隆载体的用途分类 cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3 原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载体： pGEX-2T，pGEX-3X 真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV 转录（Transcription）载体：pSL1190 普通载体（General vector）：pBR322，pUC18 第二节 质粒克隆载体 质粒载体的一般特性 质粒的组成与构型 　 细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子 细胞外：超螺旋、开环，线形 质粒DNA分子的大小：细菌质粒的大小相差较大，小的仅不足1kb，大的可达数百kb. 不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同的质粒不能存在于同一细胞中． 可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新的宿主细胞中． 复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制，其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制，质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列． 6）相关基因 A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积累到足以阻止质粒的复制． B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制． C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同一宿主细胞中． D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移． E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr． F）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）． G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等． H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒． ２ 几种常见的质粒载体 １）pBR322：含有双抗基因（Apr，Tcr）Col E1 　 复制起始子 2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在Lac Z’区组装了MCS． pUC 18-19多克隆位点 3）pBluescript M13： 含有M13噬菌体DNA复制起点的载　 体，该起点以互为相反方向插入到含有T3和T7噬菌体启动　 子的一个来自pUC质粒的载体当中． pBluescript M13多克隆位点 4）Ti质粒载体 病毒区基因及功能 Ti质粒T-DNA的边界序列 ３ 质粒载体的构建 1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行松弛型复制. * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori) 2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) *构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) *构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片段较大. 3.2 pBR322质粒载体的构建 ３.3 pUC18-19 质粒载体的构建 以pBR322为出发质粒，用含乳糖操纵子O、P和Z’的DNA片段取代pBR322上的Tcr基因，并在Z’区组入一个多克隆位点． pUC18-19的构建 3.４ 蓝藻质粒载体的构建 蓝藻作为受体细胞的特点 a）原核生物，能进行光合作用，具有固氮能力． b）基因组简单，50%的蓝藻含有质粒． c）细胞大（10-10于E.coli）储藏蛋白多，单一蛋白可达 25%，而大肠杆菌仅为5%． d）蛋白更新慢，容受性比较大 e）蛋白酶的降解作用比较低，产物比