33酶的提取与分离纯化.pptVIP

二、层析法 1 概况 层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 ① 层析法的基本原理 利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。 流动相：携带样品流过整个系统的流体.有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相: 静止不动的一相.两种状态 *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相 ② 层析法的分类 ●按两相所处的状态分类： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析 ●按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附 性能的差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相 之间的分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂 亲和力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小 的组分阻滞作用的不同。 ②吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。 ●吸附剂的选择： 根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭 ①基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。 4 离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC） ①原理: 根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。 6 亲和层析(Affinity Chromatography) 自学 由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。 又称： 功能层析（function chromatography） 生物专一吸附（biospecific adsorption） 选择层析（selective chromatography） 7 高效（压）液相层析 （HPLC：High Performance（pressure） Liquid Chromatography ） 特点：使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高;溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 固定相（柱填料）： 常用坚硬、耐高压，粒度小的硅胶。 ▼琼脂糖凝胶（agarose gel) 商品名:Sepharose （瑞典）; Bio-Gel A (美国） 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。 ★ 10 8 6 4 2 1 10～500×103 10～1500 10～5000 40～15000 100～50000 1000～150000 ? 0.5m Bio-Gel A 1.5m 5m 15m 50m 150m 同上 ? 同上 ? 6B Sepharose CL 4B 2B 6 4 2 104～3×106 105～3×107 106～108 ? 6B Sepharose 4B 2B 含琼脂糖（℅） 使用范围（蛋白质的分子量） 型号 Sepharose及Bio-gel A 型号 ★ ▼聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel） 商品名为Bio-Gel,型号从 Bio-Gel P－2至P-300，P值越大，孔径也越大。 以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。 ★ ★ ●离子交换剂： 组成:由载体、电荷基团和反离子构成。 如羧甲基纤