生物化学课件--第五章 蛋白质III蛋白质的性质、分离与鉴定.pptVIP

拟南芥AtKP1 在各种器官中的免疫印迹分析 AtKP1抗体的特异性鉴定 蛋白质分离可分别根据其 、 、 、 性质进行。 蛋白质在电泳胶上的迁移率与蛋白质分子 、 和 有关。 不连续电泳分离效果好是因为它同时具有 、 、 三个效应。 DEAE-cellulose 是一种 。 蛋白质混合物经凝胶过滤后，大分子先于小分子被洗脱。（） 盐析和透析均可用于蛋白质除盐。（） 羧甲基纤维素属于阳离子交换剂。（） 第三节 蛋白质的鉴定 一、蛋白质分子量的测定 （一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS－PAGE 变性电泳 在巯基乙醇存在下， 蛋白质亚基分开，多肽链伸展；然后SDS与多肽链以1.4:1的重量比结合成复合物。 SDS与蛋白质的结合改变了蛋白质分子的带电情况和分子形状 因此当蛋白质在电场中移动时，其迁移率仅与其分子量有关。 蛋白质分子量M与迁移率?的关系式： Log M = a - b ? 用已知分子量的标准蛋白在同样条件下电泳，分别测其迁移率，做成标准曲线。 测出未知蛋白质的迁移率，从图上查得蛋白质分子量。 SDS测定蛋白质分子量的特点： 蛋白质已变性； 对多亚基蛋白，测定的是亚基的分子量。 （二）凝胶过滤 蛋白质分子量与洗脱体积关系式： Log M = k1-k2Ve 标准蛋白洗脱曲线 测出未知蛋白质的洗脱体积，从图上查出蛋白质分子量。 特点： 测的是天然蛋白质分子量； 适合球状分子。 （三）沉降速度法 蛋白质在离心力作用下发生沉降，沉降速度与蛋白质分子分子量、密度、形状有关。 对特定蛋白质来讲，单位离心力场的沉降速度为一定值，称为沉降系数（sedimentation coefficient）。 沉降系数通常用Svedberg 单位（S）表示。 一个S等于10-13秒。 斯维得贝格（Svedberg）方程： 沉降系数越大 分子量越大。 （四）蛋白质分子量测定新技术 1. Recombinant DNA technology 2. Electrospray Mass Spectrometry 二、蛋白质纯度的鉴定 （一）电泳一条带 （二）沉降分析图谱一个峰 （三）溶解度曲线一个折点 （四）结晶 三、蛋白质含量的测定 1. 凯氏定氮法 2. 双缩脲法 3. Folin-酚法(Lowry法) 4. 考马斯亮蓝法 5. 紫外吸收法 四、蛋白质免疫印迹分析 （ immunoblot，western blot） （一）原理 蛋白质的凝胶电泳分离； 抗原-抗体间的特异结合。 Antibody（Ab） * 第五章 蛋白质III：蛋白质的性质、分离与鉴定 ?第一节 蛋白质性质 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质等电点（pI） 溶解度最小 二、蛋白质分子的大小 KD， kd，kD，kDa （kilodalton） 寡聚蛋白质（oligometric protein） 超分子复合物（supramolecular complex） 蛋白质分子量可粗略估计（AA平均分子量约为110 dalton） 三、蛋白质的胶体性质 质点范围：1-100 nm 蛋白质胶体系统稳定的原因： 水化层（hydration mantle） 双电层（electric double layer） 四、沉淀蛋白质的方法 （一）盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐，能脱去蛋白质分子水化层，并中和其电荷，从而使蛋白质从溶液中沉淀出来。中性盐的这种沉淀作用叫盐析作用（salting out）。 用途：浓缩、分级分离。 （二）有机溶剂沉淀法 （三）重金属盐沉淀 （四）有机酸沉淀法 （五）加热变性沉淀法 第二节 蛋白质的分离纯化 ?一、蛋白质分离提纯的一般原则 高纯度、高活性、高回收率 二、蛋白质的分离方法 1.透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration） 半透膜 （玻璃纸，火棉纸） 透析常用于蛋白质溶液的除盐 超滤常用于蛋白质溶液的除盐、浓缩 （一）根据分子大小不同的分离方法 2. 密度梯度离心 （density gradient ultracentrifugation） 常见有蔗糖密度梯度（连续、不连续） 质量和密度大的蛋白质分子沉降快 3.凝胶过滤（gel filtration chromatography） 分子筛层析，分