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第六章 基因文库的构建与目的基因的获得 新疆农业大学农学院 陈全家 第六章 基因文库的构建和目的基因的分离 目的基因： 已知基因： 未知基因：构建基因文库 特定探针的制备 文库的筛选（筛库） 含目的基因的克隆 基因文库或DNA文库 用于基因克隆的DNA材料的来源 从特定组织提取的染色体基因组DNA基因组文库 mRNA反转录成的cDNA拷贝cDNA文库 用于基因克隆的DNA材料的选择 如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推导出来； 如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。 基因组文库 (Genomic library) 定 义： 某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中，这个群体就称为该生物基因组的文库 目 的： a）分离有用的目的基因 b）保存某种生物的全部基因 相对于cDNA文库，基因组文库的优点： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段的序列，不能用于研究基因编码区外侧的调控序列的结构与功能。 第一节 原核生物基因组文库的构建 一、原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA 要求：制备的DNA的长度为100-200kb， 防止在制备过程中的机械断裂 二、基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024 2、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因： 10 kb b) 克隆基因族： 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量 DNA的不完全酶切 4、克隆片段的大小与构建文库克隆子的关系 以人?-珠蛋白基因为例，其大小约为1.5kb，而人的单倍体基因组总长度达3?106kb左右。 理论克隆数： 文库理论克隆子数＝　 基因组DNA总长 　　 　 　　　　　　　 ＤＮＡ片段平均长度 3?106 / 1.5 = 实际克隆数： 由于DNA片段是随机克隆的，因此理论值只是基因组基因文库所需要的最小数值。从统计学上讲，一个完全的基因文库就必须含有3—10倍于最低重组体克隆数的克隆。 1975年，L. Clarke和J. Carbon提出了一种计算一个完全基因文库需要实际克隆数的公式。 文库实际克隆子数＝　ｌｎ（１－ｐ） 　　　 　　　　　　　　　 ｌｎ（１－ｆ） 　　 ｆ＝　 DNA片段平均长度 　　　　　 　基因组ＤＮＡ的总长 要求：构建的基因组文库含目的DNA片段（基因）的几率（ｐ）99% 对于人?-珠蛋白基因的例子，N值应是： ｌｎ（１－0.99） N = ｌｎ[1 -（ 1.5 ? 100 / 3?106 ）] = 9.2 ?106 三、酶切片段与克隆载体连接 １、酶切片段的分离与纯化 １）低熔点琼脂糖回收目的片段 ２）试剂盒回收目的片段 2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择　 质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范围为10kb) ?载体可承载25kb DNA左右片段(有效的范围为15 kb) Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有效的范围为40 kb) 四、重组ＤＮＡ转化受体细胞 １、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 　　常见的