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载体的构建 Construction of vector  陈玉芹 转基因技术的一般实验流程 载体的功能及特性 载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 一、载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体应具备的条件 1.具有对受体细胞的可转移性 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.长度尽可能小，以提高其载装能力 4.具有多种单一的酶切位点 5.具有合适的选择性标记 植物基因工程载体 克隆载体 中间克隆载体 中间载体 中间表达载体 植物基因工程载体 卸甲载体 质粒的提取 原理 质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而分离质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA。 方法 碱裂解法、溴乙锭-氯化铯密度剃度离心法、DNA质粒释放法、羟基磷灰石柱层析法及酸酚法。 分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 碱裂解法 在pH12.0—12.5的碱性条件下加热时，连接DNA互补链之间的氢键会断裂，但由于ccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然紧密地结合在一起。与此相反，线性DNA的两条链则完全分开。 碱裂解法提取质粒DNA 1、培养细菌 将带有pKANNIBAL的大肠杆菌接种在10ml含卡那霉素的LB培养液中，37℃摇床培养12h。 2、收集和裂解细菌 （1）取1.5ml菌液置Eppendorf小离心管中，4℃,12000rpm离心1-2min，弃上清。 （2）加入100ul预冷的溶液I，充分混匀，吹打。 溶液I： 50mmol/l葡萄糖 25mmol/lTris-cl(PH=8.0) 10mmol/lEDTA(PH=8.0) 注：溶液I需高压蒸气灭菌15min，贮存于4℃。 （3）加入200ul新配制的溶液Ⅱ。加盖后快速颠倒5次以混合内容物，勿振荡。 溶液Ⅱ：0.2mol/lNaOH(临用前用10mol/l贮存液现用现稀释） 1%SDS （4）加150ul冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻混匀，冰浴10min。4℃，12000rpm离心10min，转移上清至另一新离心管中。 溶液Ⅲ： 5mol/l 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml （5）加入等体积的酚：氯仿，充分混匀。4℃， 12000rpm离心10min，吸上清。 （6）加入0.8-1倍体积的异丙醇，放入-20℃，10min。4℃， 12000rpm离心10min，弃上清。 （7）加入70%乙醇300-400ul。4℃，12000rpm离心5min,弃上清。 （8）吸干，加入20ul无菌水或TE缓冲液溶解。 （9）电泳检测。 大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定 感受态细胞(competent cells): 受体细胞经过一些特殊的方法（如Cacl2、Rucl等化学试剂法）的处理后，细