hNIS转染结肠癌SW480细胞介导放射性碘治疗的实验研究.pdfVIP

目 录 中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3 前 言．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6 材料与方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8 结 果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17 分析与讨论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．24 结 论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26 参考文献．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．27 附 录．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29 致 谢．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．30 综 独创性声明……………………………………．．37 温州医掌院硕士掌位论文 hNlS转染结肠癌81／／480细胞介导放射性 碘治疗的实验研究 中文摘要 目的： 结肠癌起病隐匿，早期常无明显的临床表现，病情发展较慢，出现明显的症 状时大多已到了中晚期，死亡率仅次于肺癌和肝癌，占我国恶性肿瘤第三位【11。 进展期结肠癌的治疗效果多年来未见显著提高。一方面由于其生物学特性复杂且 恶性程度高；另一方面在于化疗的多药耐药性令其预后不理想。 然而临床上分化型甲状腺癌患者口服放射性碘(131I)后，能显著延长生存 率，是因为131I可被甲状腺癌细胞特异性地获取，利用131I释放的13射线达到治 疗目的。131I治疗甲状腺癌的基础是由于甲状腺细胞具有钠／碘转运体(sodium／ iodide 上的靶向治疗。 近年来，随着人类对各类肿瘤发病机制的认识不断深入，分子生物学技术的 发展，尤其是DNA重组和基因转移技术的逐步成熟，NIS作为人类肿瘤的一种 治疗基因，扩展131I在非甲状腺癌中的治疗是NIS最具前景的研究领域。我们设 想将转基因技术与放射性核素治疗相结合，将hNIS基因转染至人结肠癌SW480 细胞中，使原本不摄碘的SW480细胞获得摄取碘的能力，然后利用131I的辐射 生物效应，达到杀伤肿瘤细胞。即研究131I对结肠癌治疗的可能性。 方法： I酶切鉴定； 1．对构建好的重组质粒pcDNA3．I+-hNIS进行测序和BamHI／EcoR 进而转化到大肠杆菌中进行扩增、提取。 WB检测转染细胞hNISmRNA和蛋白的表达情况。 (I肌S-SW480) 4．行体外摄131I试验及过氯酸盐抑制实验。 5．AnneXinv-FⅡC／PI双染行流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果： ATG到终止密码子TGA的643个氨基酸，基因大小和方向完全正确。基因序列 温州医掌院：颐士掌位论文 I／EcoRI酶切并电泳鉴定酶切产物结果 和NCBI序列CDS区序列相匹配。BamH 带，与理论计算结果相符，证实本次构建质粒为重组质粒(pcDNA3．1+-hNIS)。 I／EcoR 2．扩增提取质粒琼脂糖凝胶电泳可见在7000bp左右有清晰条带，BamH I酶切电泳亦在1944bp和5405bp左右见清晰条带，说明提取质粒成功。 示可见hNISmRNA和蛋白的表达，而在对照组和空白质粒组均未检测到hNIS mRNA及蛋白的表达。说明本实验转染SW480细胞成功。 4．转染组SW480细胞经抗生素G418筛选后获得稳定表达细胞系 粒组对G418没有抗性而死亡。 达高峰，24h一48h摄131I碘曲线呈缓慢递减。而空白对照组与空白质粒组各时段 与空白质粒组的摄131I能力均增高约8倍(PO．05)。 131I能力减低约10倍(PO．05)，证明转染组的摄碘功能为hNI