人PD-1-Fc和B7-H1-Fc分子构建及真核表达.pdf

人PD。1一Fc和B7．H1．Fc分子的构建及真核表达+ 摘 要 death 1)是一个含有免疫受体酪氨酸抑制性基序 PD．1(programmed 超家族，与同为负调节共刺激分子CTLA-4的胞外区有24％同源，它为一 分子量为55KD的l墅跨麓蛋自，主要以鼙锌形式表达予滔纯豹CD4+T秘 遗袭达于辩巴组织和菲济愁组织蔷种细胞。体外实验发现：PD一{与PD．Lt 或PD—L2结合后，能抑制已经活化的T细胞增殖及产生细胞因子，特别是 抑制效应靛CD8+T细胞的功能。在抗原刺激时，PD．1．PD。L1途径能拮抗较 强烈的CD28一B7信号，揭示了PD．1，PD．L1途径在T细胞应答中的负调节作 用。PD—LI和PD。L2在菲淋巴组织的表达，提示它稍可以下调自身反应缝 T、B细胞在外周缀织中的应答。Pd-1+的C57BL／C小鼠可发生风湿、肾小 球肾炎、扩张性心肌病及SLE等多种自身免疫性疾病，表明缺乏PD一1时， 外周的自身反应性T细胞农自发活化的倾向。研究证实，增强PD一1的信号 可以下调已活化的T、B细胞在外周组织中的应答，在维持外周T、B细胞 耐受中发挥重要的作用。 因为PD．1具有负调节信号方丽的作用，是影响效应性和记忆性T细胞 功能的重要共刺激信号通路。所以它很快成为免痰学研究的一大热点分子。 为了深入探讨PD。1在调节外周耐髓中的机制及其它生物学功能，制备可溶 {生分子PD．1．Fc寿鞋PD．L1．Fc(B7．Ht—Fc)蛋白就具有重要意义：一方面， 可溶性的PD—L1．Fc结合受体后，在体内可增强PD．1对T细胞负调节作用， 当条{牛成熟时，可技开发戏一秽受疫搀制剡用于器官移撼；另一方蘧，获 +潮家壹爨科学摹金资韵谨嚣科 得的可溶性PD．1．Fc瀑白，为我们进～步探讨PD一1在免疫自稳调节中的 建位及葵在凌力学与信号转警方瑟懿凝裁奠定了坚实蠡冬基垂窭。奉研究主要 进行了以下三部分的工作： 1．夫PD．{全长eDNA豹克隧、粪孩表达载髂静麓建 扩增密编璃久PD．1全长288aa蕊eDNA彦戮，装入态隆载舔嚣，经Amp蕊 性筛选获得阳性重组子后，缀测序证实同公布的PD．1eDNA序列一致，编码 氨基羧完全一致。 性重组子，为从细胞水平研究PD—l的功能奠定了基础。 2+APD-l—Fe及B7．Ht-Fc熬冀孩表达藏俸赘榻建。 利用基因工程技术将PD．1膜外区与hlgGlFc一起装入真核表达载体 pCI．rleo中；经筛选序列测定，证实得到了PD．1和B7．Hl的可溶性表达重组 载零摹，为进…步褥到蒺可溶馥蛋自季了下了基垂塞。 3．人PD，1．Fc和B7一H1。Fc蛋白的表达，纯化和鉴定。 (1)爰嚣震傣法转繁穗孚I劾懿绠聪CHO，夹心ELISA法，证实培养上港 中有融合蛋白的表达。 初步确定它们单体的分子量与预测的基本相符，分别为42|86KD和51．76KD。 (3)曩l纯挲发光免疫鼋迹法进一步滚实珐莠上清中畜PD-1．Fe帮B7一H1一Fc 蛋白的表达，且具有免疫学活性。 蛋白A亲袭垂褥：免疫饔逮 TheConstructionand ofHumanPD一1-Fc Expression and Chimerie B7一H1-錾|e Molecule Abstract PD-tisan that tOthe immunoreceptorbelongs immunoglobulin09) and the motif inhbitory supeffamiIycontainingimmunoreceptortyrosine—based and a