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中国科技论文在线
人氧化固醇结合蛋白 8 (ORP8)重组腺病毒
载体的构建与鉴定及病毒滴度测定
郑刚,闫道广**
5 (暨南大学生命科学技术学院,广州 510632)
摘要:前期研究发现 ORP8 参与胆固醇的转运,肝细胞的增殖与凋亡过程,然而对 ORP8 在
如何参与上述过程的机制还不清楚。为了更好地在哺乳动物细胞内过表达 ORP8 来研究
ORP8 的细胞功能,本研究运用 gateway 重组克隆技术构建了稳定表达 ORP8 基因的重组腺
病毒载体。首先将 PCR 扩增出的全长 ORP8 的 cDNA 运用 BP 重组反应构建到骨架载体
10 pDown-mcs-IRES/EGFP ,得到 pDown-ORP8/IRES/EGFP 重组入门载体,然后经 LR 重组反
应将重组入门载体和目的载体 pAV.Des1d 重组得到pAV.EX1d-ORP8/IRES/EGFP 表达载体。
通过将上述表达载体转染 293A 细胞,成功包装出表达 ORP8 的重组腺病毒,并且通过
Western blot 检测及荧光检测,证明了 ORP8 在 293A 细胞中的表达,最后通过纯化浓缩,并
测定了重组病毒的滴度,得到了高滴度的腺病毒,从而为进一步研究 ORP8 的细胞功能提供
15 了实用的工具。
关键词:ORP8;gateway 重组克隆技术;重组腺病毒;病毒包装与纯化;病毒滴度
中图分类号:Q78
Construction and identification of a recombinant adenovirus
20 vector containing human oxysterol binding protein related
protein 8(ORP8) and the detection of viral titer
ZHENG Gang, YAN Daoguang
(College of Life Science and Technology, Jinan University, GuangZhou 510632)
Abstract: Previous study showed that ORP8 participated in cholesterol transport and was involved
25 in liver cell apoptosis and proliferation, but the mechanism involved of ORP8 remained unknown.
To better study the cellular functions of ORP8 in mammalian cells ,we constructed a recombinant
adenovirus vector containing ORP8 gene that could express ORP8 by using gateway recombinant
cloning technology. First, we cloned full-length ORP8 cDNA by PCR amplification and inserted it
into the
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