实验二胆红素氧化酶的初步分离纯化.docVIP

实验二 胆红素氧化酶的初步分离纯化 实验目的 1、了解酶蛋白盐析和透析的原理； 2、掌握如何用硫酸铵向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出的现象称为盐析。蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐 加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。常用中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大硫酸铵析使用前必须处理，将透析袋置于0.5mol/LEDTA溶液中煮0.5h弃去溶液用蒸镏水洗净2，2 -连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸铵)(简称ABTS)为酶的底物，在3mL反应体系中，含有2.7mlpH4.5 0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，0.1ml酶液，0.2ml1mmol/L ABTS，按次序混合并摇匀，30秒后开始记录A420，每隔15秒记一个A420nm值，连续记录6个数据，再平均。一个酶活力单位（U）：在上述条件下，15秒钟内A420nm处吸光值的变化值。 Box + ABTS（无色）-----ABTS2+（绿