630「基因工程蛋白質的表達與分析」.pdfVIP

6/306/30「「基因基因工程蛋白質工程蛋白質的表達與分析的表達與分析 」 」 6/6/3030 「「基因基因工程蛋白質工程蛋白質的的表達與分析表達與分析 」」 指導教授 ：李冠群 老師 撰寫人 ：台中高農 陳婷婷 老師 一、實驗目的 ： 認識大腸桿菌表達系統的原理 ，學習如何從經誘導表達的基因轉型菌株，藉急速冷凍/解 凍法將菌體細胞打破 ，離心收取粗蛋白上清液，取得基因工程蛋白質，接著利用親合性管柱 層析法與快速蛋白液相層析儀純化此外源基因蛋白質 ，並利用酵素活性測試，觀察受質分解 呈色反應 ，與對照組比較，證明獲得具活性的重組蛋白質。 原理 ：固定化Ni 離子親合性層析法可以專一性結合含有 6 個 His 的蛋白質 。由此觀念我 們可以利用基因工程的方法在玉純化的蛋白質後接上 6 個 His 的片段 ，之後即可利用Ni 離子 親合性管柱快速將其純化 。並利用p-nitrophenyl butyrate 作為受質測定 esterase 活性 二、實驗材料 ： 1. 緩衝溶液 ： a. Binding butter（吸附蛋白質用緩衝液 ） b. Washing butter（清洗雜蛋白用緩衝液 ） c. Elution butter（沖離標的蛋白用緩衝液 ） 2. p-nitrophenyl butyrate Reagent 3. 鐵架 、層析管柱 （內含1ml 的 HIP-Pelect Nickel Affinity Gel 吸附膠體 ）、1.5ml 微量離心管 及管架 、塑膠滴管 圖 1：實驗中所使用的三種溶液 、親合性層析管、微量試管與試管架 三、實驗步驟 ： 1. 破 ： a. 在四支微量離心管中經誘導的菌體中個別加入 30μl Binding buffer， votex 使菌液均 勻混合 ；置於液態氮中急速冷凍（1 min） →37℃恆溫水槽解凍，連續三次進行破 1 圖 2： 將微量試管放至於試管架上以液態氮的-196℃低溫凝集成冰晶 ，以便破 動作 （需 小心避免凍傷 ，最好戴手套 ） 圖 3：利用 37℃水浴槽 ，利用冷熱溫度的差異使細胞破壞 （但必須小心溫度變化太大可 能會造成試管的爆破 ） 2. 純化 ： a.以 4℃ 12000rpm 離心 10 分鐘 ，以去除 破的菌及菌體的殘骸 ，所得的上清液即為蛋 白質粗萃取液 b.以滴管取 出的粗萃取物加入管柱中 ，先流出一管 Flow through；加入 5ml Washing buffer 將不吸附的蛋白質沖出 （收集五管 ） c.加入 5ml Elution buffer 沖洗 ，收集五管 圖 4 ：利用不同緩衝溶液將粗蛋白質逐漸進行純化動作 3. 活性分析 ： 2 a.各管加入 100μl 受質 ；觀察各管呈色變化