应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白.pdf

中 文 摘 要 应用噬菌体展示技术筛选 乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白 摘 要 目的:乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害人类健康的致 病因子。在我国，它是导致肝炎、肝硬化、肝细胞癌的主要 原因。HBV属嗜肝DNA病毒，其基因组为3.2kb部分双链的 环状DNA.HBV基因组的功能单位十分密集，高度压缩，重 复利用。HBV核心启动子(HBVCorepromoter,CP)在HBV的 转录和复制上起重要作用，指导前基因组mRNA和前核心 mRNA转录。山于病毒基因的表达与调控是研究病毒复制的 核心问题，所以本文旨在通过研究与HBVCP结合的肝细胞 特异性蛋白质因子，进一步了解HBVCP在病毒致病过程中 的作用。 方法:根据文献报道设计上下游引物，采用聚合酶链反 应((Polymerasechainreaction,PCR)技术克隆了HBVCP的基因 片段，将其与氯霉素乙酞转移酶(Chloramphenicolacetyltransfe -rase,CAT报告基因载体连接，构建了重组报告基因载体 pCATCP，转染人肝癌细胞系HepG2，同时转染实验室保存 的不 同的 HBV CP变异株 ，用酶联免疫吸附实验 (Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)法检测氯霉素乙 酞转移酶的表达，验证其活性。以此结论为基础，我们应用 噬菌体展示技术筛选HBVCP结合蛋白基因，以HBVCPPCR 产物作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 4轮 “吸附一洗脱一扩增”筛选过程，将第4轮阳性噬斑裂解液 中 文 摘 要 经PCR扩增后，与pGEM-Teasy载体连接构建TA克隆载体， 转化大肠杆菌DH5a，最后对所筛选克隆进行DNA序列分 析和同源性搜索，确定了和HBVCP结合的肝细胞蛋白基因 序列。我们挑选了p:微球蛋白(R2-microglobulin,p2-m)和核孔 复合体相互作用蛋白伽uclearporecomplexinteracting protein,NPIP)，构建了它们的真核表达载体pcDNA3.1(-)一p2-M 和pcDNA3.I(-)-NPIP，分别与pCATCP共转染HepG2细胞， 检测CAI，的表达。 结果:1.成功克隆了HBVCP的基因片段以及构建了重 组报告基因载体pCATCP，转染人肝癌细胞系HepG2细胞， 检测CAT的表达，我们克隆的HBVCP基因片段具有生物学 活性，可以明显上调CAI，的表达，而其他HBVCP变异株活 性各有不同。2.经过4轮 “吸附一洗脱一扩增”的噬菌体筛选后， 将获得的阳性克隆通过DNA序列分析和同源性搜索，确定了 三种HBVCP结合蛋白，分别是p:微球蛋白、核孔复合体相 互作用蛋白和磷脂酞肌醇激酶3相关激酶03.成功构建了真核 表达载体pcDNA3.1(-)一p2-M和pcDNA3.1(-)-NPIP，分别与重 组报告基因载体pCATCP共转染HepG2细胞，检测氯霉素乙 酞转移酶(CAT)的表达显示02微球蛋白和核孔复合体相互作 用蛋白均能明显下调HBVCP活性。 结论:我们利用HBVCPDNA表达载体的构建，民-M 和NPIP真核表达载体的构建，报告基因表达载体和真核基因 表达载体的细胞共转染技术，直接证实了民-M.NPIP与HBV CPDNA之间的结合，具有重要的生物学意义，即两种结合 蛋白可以通过与HBVCPDNA之间的结合，实现对HBVCP 的下调作用。HBVCP指导着核心蛋白、聚合酶蛋白的mRNA 中文 摘 要 的转录，同时指导着HBV前基因组RNA的转录。但是对于 HBVCP的这种调节作用，究竟是对HBV蛋白编码基因的 mRNA的转录产生下调作用，还是下调前基因组RNA的转 录，或者兼而有之，目前还不十分清楚，需要进一步的研究 加以证实。总之，应用噬菌体展示技术筛选HBVCP结合蛋 白，使我们对HBVCP的功能有了新的认识，有助于我们进 一步了解肝炎病毒与肝细胞之间相互作用的分子生物学机 制，为乙型肝炎、肝硬化和肝癌的预防和治疗提供了新的思 路。 关键词: 乙型肝炎病毒;核心启动