北冬虫夏草MAT1-1-1基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Cmgpd)的克隆和分析.pdf

摘要 子囊菌（Ascomycetes ）是真菌门中最大的一纲，本纲最重要的特征是产生 子囊(ascus)，内生子囊孢子(ascospore) 。子囊是两性核结合的场所，结合的核经 减数分裂，形成子囊孢子；其有性生殖过程的研究已有 80 多年。子囊真菌可根 据形态差异分成两组：一组是单核酵母，而另一组是丝状真菌。在所有真菌中， 众所周知的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）最有经济价值，被广泛用于面 包制作、发酵和酿酒。在丝状子囊菌中，冬虫夏草（Cordyceps sinensis）是一种 丝状真菌，在中国已经作为一种中药被广泛使用了几个世纪。 北冬虫夏草（Cordyceps militaris）作为冬虫夏草的替代品也是一种虫生真菌， 同样含有很多生物活性成分，例如虫草素（3’-脱氧腺苷）、虫草酸和虫草多糖等。 在本研究中，通过高效液相色谱法（HPLC ）和苯酚-硫酸法分别检测了冬虫夏草 和北冬虫夏草的各个部分中虫草素和虫草多糖的含量。结果表明：北冬虫夏草子 实体中的虫草素含量为 1.137%，北冬虫夏草菌丝体中的虫草素含量为 0.7162%， 冬虫夏草中的虫草素含量为 0.000523% ；北冬虫夏草子实体中的虫草多糖含量为 3.35%，北冬虫夏草菌丝体中的虫草多糖含量为 3.05%，冬虫夏草中的虫草多糖 含量为 7.83% 。 子囊真菌的菌种改良主要依靠随机突变法或经典的遗传育种法，从而筛选出 目的特性改良了的突变体或杂交后代。实验室中真菌交配是遗传分析和菌种改良 的有利工具。在异宗交配的子囊真菌中，典型的交配只能在形态相同而交配型不 同的配偶菌株间进行，而交配型可分为 MAT1 型和 MAT2 型。通常 MAT1 型和 MAT2 型由单个交配型位点MAT1 决定，因为MAT1 位点上的等位基因没有相似 性，所以这样的等位基因又被称为“独特型”（idiomorph ）。MAT1 型和 MAT2 型的独特型分别为MAT1-1 和 MAT1-2 。尽管等位基因 MAT1-1 和 MAT1-2 的核苷 酸序列相似性很低，但是 MAT1-1 和 MAT1-2 的两端侧翼序列具有高度同源性。 子囊真菌的交配型等位基因编码含已确定或推测的 DNA 结合基元的蛋白。这些 蛋白作为主要的转录调控因子，控制特异细胞的形成和有性形态的形成的途径。 对于交配型的分子特性的充分理解将能降低菌种育种过程中所需花费的劳动力。 通过基于 PCR 的交配型测试，证明本实验室保存的北冬虫夏草的交配型是 MAT1 型。虽然已有北冬虫夏草 MAT1-1 等位基因的部分 DNA 序列报道，但是 北冬虫夏草交配型基因MAT1-1-1 的 3’端序列仍然是未知的。所以通过热不对称 交错 PCR （Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR ）技术，扩增了北冬 虫夏草的MAT1-1 序列全长。结果表明等位基因 MAT1-1 上含有两个交配型基因 MAT1-1-1 和 MAT1-1-2 ，但是在MAT1-1-1 基因和 MAT1-1 的 3’端侧翼区域中间， 并没有发现其它潜在的基因。北冬虫夏草的交配型位点上的MAT1-1 的基因组织 结构与另一个同科虫生真菌高雄山虫草（C. takaomontana ）相似。另一方面，植 物病原真菌瘤座菌属（Balansia ）的菌种，麦角菌（Claviceps purpurea ）和稻香 柱菌（Epichloe typhina ）同属于麦角菌科，其与虫草菌科的关系非常近，然而这 些真菌除了含有 MAT1-1-1 和 MAT1-1-2 基因外还含有另外一个交配型基因 MAT1-1-3 。这些结果暗示麦角菌科的植物病原真菌可能是虫草菌科的虫生真菌的 较早的祖先，可能在从植物进入动物的宿主迁移中丢失了 MAT1-1-3 基因。 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD ）基 因的启动子被广泛用于驱动真菌中目的基因的组成型表达。然而，真菌的启动子 具有种属的特异性，一些实验证明异源启动子具有较低的驱动活性。为了获得一 种高效、稳定的启动子应用于将来的北冬虫夏草的转化实验，本研究利用 TAIL-PCR 技术，成功克隆了北冬虫夏草 GPD 基因全长（Cmgp