基因siRNA真核载体的构建及其效率研究.pdfVIP

2010;30(9) 南方医科大学学报(JSouthMedUniv) 窑2077 窑 HCMV-IE1基因siRNA真核载体的构建及其效率研究 1 1 1 2 1 谢妮 袁韩艳萍 袁吴瑾滨 袁袁建辉 渊 深圳大学医学院附属第一医院/ 深圳市第二人民医院袁广东深圳518035曰 2 深圳市疾病与预防控制中心袁广东深圳518020冤 摘要院目的采用RNA干扰技术研究在体外对人巨细胞病毒即刻早期 玉基因渊HCMV-IE1冤表达的沉默作用遥 方法根 据HCMV-IE1 基因表达框袁 设计siRNA干扰序列袁 重组至带U6 启动子真核表达载体袁 构建针对HCMV-IE1 基因的 siRNA真核表达载体渊pHCMV-IE1i冤曰经测序鉴定后袁脂质体法转染HEL 细胞HCMVAD169株袁应用荧光显微技术尧流 式细胞术和 RT-PCR 法检测分析 pHCMV-IE1i 对 HCMV-IE1 基因的表达干扰效果遥 结 测序结果显示针对 HCMV-IE1 基因的pHCMV-IE1i 构建成功曰 荧光显微结果表明pHCMV-IE1i 转入HEL 细胞后可以特异抑制细胞中 HCMV-IE1 基因的表达曰 流式细胞术结果显示对照细胞组HCMV-IE1 基因表达阳性率达60%以上袁 干扰细胞组 HCMV-IE1 基因表达阳性率仅达10%左右渊P0.05冤曰RT-PCR 检测结果发现pHCMV-IE1i 能显著抑制HCMV-IE1 基因 的表达渊P0.05冤遥 结论采用RNAi技术能有效抑制HCMV-IE1 基因在细胞内的表达袁对探讨其在防治HCMV感染疾 病中的作用与意义提供了科学的实验依据遥 关键词院人巨细胞病毒即刻早期玉基因曰基因表达曰RNA干扰曰真核载体 中图分类号院R34 文献标识码院A 文章编号院1673-4254渊2010冤09-2077-03 ConstructionofaeukaryoticexpressionvectorharboringthesmallinterferingRNAtargeting HCMV-IE1geneanditsgenesilencingefficiency 1 1 1 2 XIENi ,HANYan-ping,WUJin-bin,YUANJian-hui 1 2 FirstAffiliatedHospitalofShenzhenUniversity/SecondShenzhenPeoplesHospital, Shenzhen518035, China; CenterforDisease ControlandPreventionofShenzhen,Shenzhen518020,China Abstract: ObjectiveToinvestigatetheeffectofRNAinterferencetargetinghumancytomegalovirusimmediateearlygene1 (HCMV-IE1)onthegeneexpression invitro.MethodsAccordingtothesequenceofHCMV-IE1gene,thesmallinterfering RNA (siRNA) sequencesweredesignedandintroducedintotheeukaryoticexpressionvectorcontainingtheU6promoter. Afterverificationbysequence analysis, the recombinanteukaryotic plasmid (pHCMV-IE1i) wastransfectedintoHEL HCMVAD169cells. TheeffectivenessofHCMV-IE1genesilencingwasinvestigatedbyfluorescencemicroscopy, flow