1.2基因工程的基本操作程序刘引.pptVIP

三、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取； 2、基因表达载体的构建； 3、将目的基因导入受体细胞； 4、目的基因的检测与鉴定； 2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 1、目的基因的获取 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？ 1）DNA序列自动测序仪： 对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。 2）PCR技术： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。 利用PCR技术扩增目的基因 2、基因表达载体的构建——核心 目的： 单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。 2、基因表达载体的构建——核心 ①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 ②用同一种限制酶切断目的基因，使其产生同样的黏性末端。 ③将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。 2、基因表达载体的构建——核心 2、基因表达载体的构建——核心 基因表达载体的组成： 目的基因+启动子+终止子+标记基因 2、基因表达载体的构建——核心 作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还要有启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达 （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； 3、将目的基因导入受体细胞 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 3、将目的基因导入受体细胞 方法： 将目的基因导入植物细胞： 农杆菌转化法（双子叶植物和祼子植物）、基因枪法（单子叶植物）、花粉管通道法 将目的基因导入动物细胞 显微注射法 将目的基因导入微生物细胞 感受态细胞 将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞. 第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程. 第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。 3、将目的基因导入受体细胞 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？ 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少 要对受体细胞作怎样的处理？ 对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测 怎样进行检测？ 通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测 4、目的基因的检测与鉴定 检测：（分子水平） ①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因： 方法——DNA分子杂交 ②检测目的基因是否转录出了mRNA： 方法——DNA分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质： 方法——抗原——抗体杂交 （如果有，表示目的基因已经进行了翻译） DNA分子杂交技术 分子探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段（目的基因片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。 满足条件： （1）必须是单链； （2）带有容易被检测出来的标记物（如放射性同位素标记）。 核酸分子杂交实质上是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交。 DNA分子杂交示意图 如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。 DNA分子杂交示意图 用DNA分子杂交技术可鉴定两个物种之间的亲缘关系的远近。将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。如果杂合部位多，则亲缘关系近，反之则远。 4、目的基因的检测与鉴定 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。 4、目的基因的检测与鉴定 鉴定：（个体水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性