药用植物有效成分基因调控研究.docVIP

学习药用植物有效成分基因调控研究的心得 870 张敏 一、研究概况 实验生物学研究阶段:放射性同位素标记的前体 蛋白质水平研究:有效成分生物合成途径中酶 基因调控:长春花,罂粟,紫草,青蒿,红豆杉,小檗,天仙子,蔓陀罗等数十种 二、研究意义 植物: 从分子水平上对其生物合成的关键基因进行调控,促进其表达,可以提高目的产物的量,改变药用植物中各种成分之间的比例,减少甚至完全去除某些有毒成分,只是栽培措施可望而不可及的事. 细胞培养技术: 可增加有效成分生物合成过程中关键酶基因的表达量,提高和稳定悬浮培养细胞有效成分的产量,培育高产稳产的细胞系,从而彻底解决药用植物悬浮培养细胞有效成分产量低不稳定的难题,真正实现利用药用植物细胞培养技术工业化生产有效成分的目的. 问题: 有效成分的合成往往由多个酶促反应步骤并且是在特定的分化了的细胞中完成的.全面完成其生物合成 机理困难,大多数成分生物合成的分子机理都不清楚. 三、基本理论和方法 首先要对药用植物有效成分生物合成途径进行研究 然后进行药用植物有效成分生物合成各酶促反应酶的提取、分析、纯化及性质分析的研究 克隆、分离相应的基因并对其表达特征进行研究 最后利用转基因技术对有关基因进行人工调控。 四、药用植物有效成分生物合成途径 同位素标记的特定前体喂饲药用植物的植株。分离，纯化，结 同位素标记的特定前体喂饲药用植构鉴定。物的培养细胞。其相关的研究结果一方面可供整体植株有效成分生物合成途径的研究时参考，并进行比较；另一方面，药用植株培养细胞有效成分生物合成途径的研究结果还可直接应用于利用细胞培养工业化生产有效目的成分的实践中。 五、参与药用植物有效成分生物合成相关酶的提取、纯化及性质分析 早年从分化的植物材料中提取粗提物。粗提物种酚类物质含量高，且参与有效成分生物合成的酶的活性低。如生物碱生物合成早期前体往往是易变的酚类化合物，而且生物碱的积累要经过几个月甚至几年的时间才能达到一定的含量。 植物细胞培养不存在这些问题。药用植物的培养细胞十分均一，目的产物的累积时间往往要比整体植株中目的产物的累积时间短得多，特别是用诱导子处理培养细胞后有效成分的含量还可进一步提高。 已经分离和鉴定了80多种参与生物碱生物合成的酶。 六、提取酶的存在形式 在代谢过程中分泌细胞或组织之外的胞外酶。 分布在细胞内部或是细胞的结构物的酶类，先要将细胞破碎，才能将酶有效地提取出来。有时首先将细胞器、细胞碎片进行分级分离，然后再提取。如参与生物碱生物合成的细胞色素P450存在于植物细胞微粒体中。 七、提取步骤 冻干燥，组织及细胞的破碎：捣碎法，匀浆法，研磨法，高压匀浆器的挤压法。冷超声波振荡，渗透压冲击，酶解等。 酶的提取：低离子强度的盐溶液或提取缓冲液。如磷缓等。 细胞器的分离 叶绿体的分离：类萜的合成 微粒体的分离：生物碱的合成 八、酶的分离纯化 分离：盐析法，有机溶剂沉淀法 纯化：离子交换层析，凝胶层析，亲和层析 酶的性质分析：纯度，酶活力，酶促动力学（Km测定、激活及抑制剂）、酶的最适pH值、分子量、氨基酸序列等性质研究。 九、酶纯度鉴别 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳法 N-末端氨基酸残基分析 高效液相色谱 沉降分析 扩散分析法 2-3种方法 十、酶活力 分光光度法：通过测定酶和底物开始反应后在一定光波下光密度值的变化来测定其活性 同位素法：利用放射性同位素标记的底物与酶反应，并在 应结束时，加入过量的酸使未反应的底物成气态放出，用液闪仪测定剩余的酸稳定化合物中放射性的量，以之代表该酶促反应产物的量。 十一、基因组DNA克隆法 优点：cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，而没有包括基因组DNA的间隔序列。 基因组DNA克隆法是先用限制性内切酶和超声波等机械 法将完整的植物基因组DNA随机地切割成一群长短不一的DNA片段，在将这些片段连接进适当的DNA载体中，重组体DNA转化进感受态细胞或是转染宿主细胞后，在细胞内可以大量扩增，得到这种药用植物基因组所有不用大小DNA片段的克隆群。 十二、利用(噬菌体作载体构建基因文库的基本步骤 用限制性内切酶切割载体DNA，使载体形成了与外源DNA连接的粘性末端 使载体两臂的cos区域发生退火，并去除对噬菌体(生长繁殖不重要的中部区域 退火的两臂与外源DNA片段发生连接，形成多连体 体外包装DNA多连体分子 重组噬菌体侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑。 十三、酵母人工染色体克隆（YAC） 在YAC克隆中，外源植物DNA被连接在YAC载体两臂 间，YAC两臂含有使整个克隆在酵母细胞中保持稳定并能进行正常复制和分离的必需基因，同时还含有一些用作选择标记的基因（如营养需求等），这样YAC克隆在酵母细胞中的行为就