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结冷胶发酵条件的优化 主讲人：袁方 张伟 专 业:生物化工 框架 研究背景 结冷胶是近年来所发现的最有 发展前景的微生物多糖之一，过去曾称杂多糖PS-60，1987年，由美国科学家Kaneko and Kang在 默克公司Kelco分公司 实验室发现了结冷胶，后来该公司利用稍动鞘脂假单胞菌为生产菌，将其正式投入生产。 结冷胶是一种高分子阴离子型多糖，主链是线性四糖重复单位，包括β-D-葡萄糖，β-D-葡萄糖醛酸， α-(1-4)-L-鼠李糖，其组成比例大约为2:1:1，分子量高达500KD，有一些基团被乙酰基和L-甘油酸酯（或盐）取代。 研究背景 结 冷 胶 以 两 种 形 式 存 在，天然 结冷胶和低酰 基结冷胶 研究背景 结冷胶生物合成的可能途径 图中PGI：磷酸葡萄糖异构酶，PGM：磷酸葡萄糖变位酶，UGP：UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，TGP：TDP-葡萄糖焦磷酸化酶，UGD：UDP-葡萄糖脱氢酶，TRS：TDP-鼠李糖合成酶 研究背景 结冷胶的特性 1.极好的稳定性。结冷胶形成的凝胶具有极好的热稳定性，而且还能耐酸碱。结冷胶可以替代琼脂作为微生物培养基的胶凝剂。 2.独特的澄清透明性 3.良好的配伍性 结冷胶应用 1 面制品中的应用.可以改善面条的口 感，还可以提 高它 们的粘 度，弹 性以及硬度 2 乳制品中的应用.具有极其良好的增 稠性和凝胶性 3代替琼脂。对于对培养基澄清度要求非常高的嗜温微生物而言，高纯度结冷胶代替 琼 脂，可以解 决这个问题。 课题方向 1.从 实验保 藏的菌种 出发，通过紫外线（UV）诱 变和亚硝 基胍（NTG）诱变，筛选得 到高产结冷胶的菌 株； 2.通过单因素实验和响应面实验对菌株发酵 产结冷胶的 培养基成分和最适培养条 件进 行优化，确定了菌株的最佳 的发酵条件。并通过10L、1吨发酵罐的实验，进一步摸索菌株的 特性，从 而 使其产量 提高； 3.研究了离子对结 冷胶凝胶温度 及凝胶强度 的 影响，可为 后提取 提供一定的 理论 参数。 4.对结 冷胶的 后提取进 行了初 步的 摸索。 1.结冷胶菌种的诱变 本实验室 保藏了 一株生产结 冷胶的菌株Pseudomonas elodea（伊乐假单胞菌），但 该菌 株产结冷 胶的 量较低，仅有 3.9g/L左 右，不适合 工业化 生产。 在研 究过 程中，以实验室原有 菌株为出 发菌株 进行了 紫外线（UV）、亚硝 基胍（NTG）诱变处理，经过 大量 的自然分 离，获得了一 株转化 率较高的 菌株P-8， 经 发酵试验检测，其产 胶得率 达到14.2g/L，是初 始菌 株产 胶率的3.64倍。 1.结冷胶菌种的诱变 菌株及菌落形态特征 1.结冷胶菌种的诱变 1.结冷胶菌种的诱变（小结） 以实验室原有菌株为出发菌株，进行了紫外线（UV）、亚硝基胍（NTG）诱变处理，得到一株产胶率高并且性能稳定的菌株P-8，使结冷胶的产胶得率由3.9g/L提高到14.2g/L，提高了2.64倍。 并且，该菌株碳源利用较广，能很好的利用有机氮源，最适生长温度为28℃-30℃，最适生长初始pH为6.5～7.0，用磷酸盐缓冲液可保藏半年时间。 2.结冷胶发酵条件的研究 菌株的高产特性不仅由其遗传特性决定，而且也由其所处的环境条件决定。 先在摇瓶培养的基础上，确定了较适宜的发酵培养基组成和最佳的培养条件。然后在摇瓶的基础上，在发酵罐中进一步优化伊乐假单胞菌生产结冷胶的条件。从而实现结冷胶高产量和高生产强度的相对统一。 2.结冷胶发酵条件的研究 1 种龄及接种量对结冷胶发酵的影响 2 初始pH对发酵的影响 3 温度对发酵的影响 4 培养基装液量及摇床转速对发酵的影响 2.结冷胶发酵条件的研究 1 种龄及接种量对结冷胶发酵的影响 种子的活力主要由种子液的种龄决定，菌体生长最旺盛阶段为对数生长期，选择对数生长中后期的种子作为种子液为最佳。本菌株对数生长中后期的种子液从外观来看有一定的粘稠性，镜检菌体形态均一，粗壮，染色均匀。 结冷胶发酵条件的研究 本实验中将不同种龄（16-32hr）的种子培养液皆以相同的接种量（10%）分别接入摇瓶震荡培养（培养时间为72h），结果如图3-9所示。由此可见，种子液最佳种龄为24h，种龄过长或过短，发酵液的得率偏低。因此选用24h作为最佳接种时间。 2.结冷胶发酵条件的研究 2初始pH对发酵的影响 发酵过程中底物的消耗速率、细胞生长速率与接种量的大小有密切的关系，尤其是延迟期的长短与接种量关系极其密切，因此这也间接影响了发酵周期的长短和目的产物的产量。接种量过少会导致菌体延滞期延长，从而延长整个发酵周期。而过多的接种量会导致菌体的过快生长，消耗了大量的底物，从而影响