卤醇脱卤酶HheC催化特性-对映体选择性改造研究毕业论文.docxVIP

内蒙古科技大学本科生毕业设计说明书（毕业论文） 题 目：卤醇脱卤酶HheC催化特性对映体选择性的改造研究 学生姓名： 学 号： 专 业：生物工程 班 级：2010级 指导教师： 卤醇脱卤酶HheC催化特性-对映体选择性的改造研究摘 要 卤醇脱卤酶可以催化环境污染物中邻卤醇的碳-卤键断裂生成环氧化物，也能接受不同的亲核试剂进行环氧化物开环反应形成卤代醇。卤醇脱卤酶HheC因为对芳香族邻卤醇具有较高的对映体选择性，并且可以降解环境中的含卤污染物而受到工业生产的重视，生产高价值的手性药物中间体。卤醇脱卤酶HheC不仅对芳香族邻卤醇具有较高的対映体选择性，而且能够参与1,3-二氯-2-丙醇、表卤醇和1,2-二溴乙烷等重要环境污染物的生物降解途径，同时也参与生产高价值的手性药物中间体。为更好的研究卤醇脱卤酶HheC在手性药物合成方面的作用，本文运用半理性设计方法对卤醇脱卤酶HheC的対映体选择性进行改造。最近的研究显示，底物结合口袋内部的氨基酸对酶的対映体选择性有重要的影响。为了获得卤醇脱卤酶HheC在开环反应中対映体选择性较好的突变体，基于本实验室之前对HheC対映体选择性改造所构建R型和S型文库，利用1,3-二氯-2-丙醇为底物的比色法在96孔板中筛选出针对脱卤反应的良性突变体若干，从这些突变体中挑选出三种类型的突变体与三种底物—1,2-环氧己烷，3,3-二甲基-1,2-环氧丁烷及1,2-环氧-3-甲基丁烷分别进行N3-介导环氧化物开环反应,再利用气相色谱进行检测。最终，在其中一个突变文库中获得了针对1,2-环氧己烷対映体选择性得到提高的突变体A-1，A-5，F-2。说明84位点突变成GTC（Val）对HheC的开环反应的対映体选择性有较大影响。但是，从脱卤反应筛选得到的突变体，在其他底物的対映体选择性筛选中，并未得到较好结果。说明，影响HheC开环反应対映体选择性的位点不仅包括了84, 86, 134, 176位点，可能还包括了HheC底物结合口袋附近其他位点。关键词： 卤醇脱卤酶HheC；对映体选择性；突变文库构建 ABSTRACT Halohydrin dehalogenase can catalyze the breakage of halohydrin’s carbon-halogen bond. It can also accept different nucleophiles to conduct epoxide ring-opening reaction to form β-substituted alcohols. As halohydrin dehalogenase HheC has a high enantioselectivity toward aromatic halohydrin and it can degrade the halogen-containing contaminants in the environment, it has been paid more attention in industrial production.Halohydrin dehalogenase HheC have a high stereoselectivity to aromatic halohydrin. It can participates in the degradation pathway of 1,3-dichloro-2-propanol, epihalohydrin and 1,2-dibromoethane and other important environmental pollutants. It is also involved in the production of high value chiral drug intermediates. To study the fuction of halohydrin dehalogenase HheC in the synthesis of chiral drugs, this paper use semi-rational design approach to improve the alcohol dehalogenase halogen’s stereoselectivity. Recent studies showed that amino acids located around the substate binding pocket have an important influence to the enzymes’stereoselectivity. To obtain halohydrin dehalogenas