携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建.pdfVIP

广东医学 2012年3月 第33卷第 5期 GuangdongMedicalJournalMar．2012，Vo1．33，No．5 · 583 · 携带凋亡抑制蛋 白LivinoL基因的重组腺病毒 载体的构建术 谢楚海 ，吴波以 ，付霞霏 ，胡海澜 广州医学院第二附属医院骨科 (广州510260)；南方医科大学珠江医院妇产科(广州510282) 摘【要】 目的 构建携带凋亡抑制蛋白Livinc~和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd—Livinct。方 法 PCR扩增Livinc~基因片段 ，克隆至穿梭质粒 pAdTrack—CMV中，再与骨架质粒 pAdEasy一1在大肠杆菌 BJ5183中同源重组，在人胚 肾293细胞 中包装扩增得到携带 Livinct和 GFP基 因的重组腺病毒 pAd—GFP— Livinot。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果 经酶切及PCR鉴定证实携带Livinct的重组腺病毒栽体构建成 功，并可在人胚肾293细胞中表达，病毒滴度2．15X10 pfu／mL。结论 成功构建了携带Livinc~和GFP基因的重 组腺病毒载体系统，为进一步研究Livino~的生物学特性奠定了基础。 【关键词】 Livinct；腺病毒；绿色荧光蛋白 ConstructionofrecombinantLivinacarryingadenovirusvector． XIEChu—hai，WU17o～ ，FUXia一，ei。HU Hai—lan． OrthopedicDepartment，kSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege，Guangzhou510260．China A【bstract】 Objective ToconstructtherecombinantadenovirusvectorcarryingLivinctgeneandgreenfluorescent protein(GFP)withAdEasy一1system．Methods Livinc~genewasamplifiedwithPCRandclonedintothepAdTrack— CMV shuttlevector．andsubsequentlycotransducedintoE．coliBJ5183cellswithpAdEasy—lplasmidforhomologousre— combination．ThelinearizedrecombinantplasmidwassubsequentlytransfeetedintoHEK293cells．Therecombinantade— noviurspad—GFP—LivinctwasdetectedbyPCR andrestfiction enzymedigestionanalysis．Results Therecombinant plasmidandtherecombinantadenoviursvectorspAd—GFP—Livinc~wereidentifiedbyrestrictionenzymedigestionanaly— sis．RecombinnatadenoviurspAd—GFP—Livinc~wasconfirmedbyPCRandsuccessfullyexpressedinHEK293cellswith viurstiterof2．15 ×10 pfu／mL．Conclusion TherecombinantviurspAd—GFP～Livincthasbeensuccessfullycon— sturcted，whichfacilitatesfurtherresearchofLivinctfunction． K【eywords】 Livinct；adenoviurs；greenfluorescentprotein Livin是近年来发现的人类凋亡抑制蛋 白(inhibi- pAdTrack—CMV(卡那霉素抗性，约9．2kb)，大肠杆菌 torofapoptosisprotein)家族的新成员…，Livin的抗凋 DI-ISc~、人胚肾293细胞株、骨肉瘤 MG一63细胞株。 亡机制与Caspases作用途径及 TAK1／JNK1途径有关： PCR引物 自行设计，大连生物有 限公司合成 。 在 Caspases途径中Livin通过抑制 Caspase活性 ，阻断 RT—PCR试剂盒、T4DNA连