柞蚕热激蛋白90基因克隆与表达分析.pdfVIP

．、+、￡誓’ 捅 要 柞蚕是一种具有重要经济价值的野生绢丝昆虫，属于鳞翅目、大蚕蛾科、柞蚕属。 柞蚕茧可作为纺织工业原料使用，其幼虫和蛹还具有重要的药用和食用价值。尽管昆 虫在高温和低温等不利环境下的生活史对策已有较多研究报道，但柞蚕对于高温耐受 shock 性的生化与分子机制仍未被解析。热激蛋白(heat protein Hsp)是一种抗逆蛋 白，在细胞受到胁迫时表达量会增加，对细胞起到一种保护作用，帮助生物机体度过 不利环境条件。近期的研究还表明，HSPs还与生物的生长、发育与分化、细胞内信 号传导和育性转化有关。本论文在克隆获得柞蚕热激蛋白90(Hsp90)基因序列的基 础上，进一步对蛹在不同温度胁迫下的相对表达量进行了测定，并且大肠杆菌内进行 了成功的表达，从而为阐明柞蚕耐高温的分子机制提供参考。主要结果如下： 1．柞蚕Hsp90克隆及序列分析： 根据GenBank中昆虫热激蛋白基因序列同源性设计简并引物，利用反转录聚合 bp，开 放阅读框长2154 bp，编码717个氨基酸。预测的该蛋白的相对分子量和等电点分别 为82．6 kDa和5．0。该序列具有Hsp90家族的典型特征和特殊的功能结构域，并且 与多种生物的Hsp90核苷酸序列以及推导的氨基酸序列都具有较高的同源性。系统 进化分析表明，柞蚕Hsp90和天蚕的Hsp90氨基酸同源性最高，为94．5％。 2．高温胁迫下柞蚕体内Hsp90基因表达量的变化 提取柞蚕幼虫及蛹期的不同组织的RNA，反转录为第一链cDNA进行半定量 量无明显差异。 利用18S rRNA作为内参基因，以柞蚕不同组织的RNA为模板，结合实时荧光 定量PCR(SBGY Real．timePCR)技术分别检测了25℃和42。C胁迫处理30 min后柞 蚕蛹期体内Hsp90基因相对表达量。结果表明，Hsp90基因表达量随着温度升高呈 Hsp90基因较高的表达水平说明这种蛋白在柞蚕抗高温中起到一定的保护作用。 3．Hsp90基因的原核表达 泳和蛋白纯化检测，目的蛋白得到了稳定的表达。 关键词：柞蚕，热激蛋白90，克隆，实时荧光定量PCR，原核表达 Abstract Antheraeaisakindof wild tO insect，which pernyi deveopingilk—producing blongs SaturniidaeAntheraea．Anthet’aea has officinalandedible Lepidopte7’a pet。nyi good values for economical in asrawmaterials．Oakcocoonto utilizing industry except spinning makeuseofrawmaterialoftextileindustrial．andthe alsohave medicinal、’alue pupa high andedible of 70and mRNAlevelsin