GB/T 19915.8-2005猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法.pdf

ICS 07.100.30 C53 场日 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T 19915.8-2005 猪链球菌2型毒力因子荧光PCR 检测方法 Protocolofreal-timePCRassayforvirulencefactorsof Streptococcussuistype2 2005-09-27发布 2005-11-01实施 本替斜臀雍嘘臀缝臀臀暴发“ GBJT19915.8-2005 前 口翎 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化管理委员会归口。 本标准由中国检验检疫科学研究院和江苏出人境检验检疫局负责起草。 本标准主要起草人：林祥梅、吴绍强、韩雪清、贾广乐、刘建、梅琳、陈国强、张敬友、姜众、唐泰山。 本标准为首次发布。 GB/T19915.8-2005 猪链球菌2型毒力因子荧光PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪链球菌2型毒力因子MRP和EF检测的荧光PCR操作方法。 本标准适用于检测生猪拭子、增菌培养物、疑似病料及猪组织样品中猪链球菌2型菌株的致病力。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 毒力因子 virulencefactor 猪链球菌2型菌株的致病力与其毒力因子直接相关。猪链球菌2型的毒力因子有溶菌酶释放蛋白 (MRP)、胞外因子 E（F)、溶血素、荚膜多糖以及44kDa蛋白、IgG结合蛋白、纤毛粘着素等。其中，溶菌 酶释放蛋白M（RP)和胞外因子 E（F)是最主要的两个毒力因子，可作为判定菌株毒力的指标。一般认 为表型MRP+EF＋为强致病株，MRP+EF一为弱致病株，MRP-EF一为非致病株，未发现 MRP一EF＋表型。 3 缩略语 本标准采用下列缩略语： 荧光PCR 荧光聚合酶链反应 MRP 溶菌酶释放蛋白 EF 胞外因子 Ct值 荧光信号到达设定的闹值所经历的循环数 FAM 6-梭基荧光素 TAMRA 四甲基罗丹明 4 实验材料与仪器 4.1 实验试荆 实验试剂包括： — 猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测引物、探针、阳性对照及常规PCR反应试剂； — 商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。 4.2 仪器 所用仪器包括： — 荧光PCR仪； — 高速冷冻离心机； — 台式离心机； — 旋涡混匀器； — 冰箱(2（℃一8℃和一20℃两种）； — 微量可调移液器 0（.1j.L-2tAL,2tL-20ttL,20pL-200pL,100pL-1000pL等规格）和 相应配套的吸头。 GB/T19915.8-2005 5 操作方法 5.1 方法概要 荧光PCR方法是一种快速、灵敏、特异的检测病原体的方法。本研究选择猪链球菌2型的MRP 和EF两个毒力因子基因设计引物进行 PCR，同时在扩增序列中间设计了荧光探针，进行多重荧光 PCR检测。反应结束即可根据扩增曲线判定有无目的基因，从而确定待检菌是否含有猪链球菌2型 MRP和EF毒力因子基因，并据此判定其致病力。 5.2 操作