GB/T 19915.6-2005猪源链球菌通用荧光PCR检测方法.pdf

ICS07.100.30 一 一 CS‘ 场 1 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T 19915.6-2005 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法 Methodofthereal-timePCRforthedetectionofStreptococcussuis 2005-09-27发布 2005-11-01实施 率督留瞥臀瓣譬蓬臀臀暴发“ GB/T19915.6-2005 目U 胃 本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：张鹤晓、宋立、高志强、宁宜宝、周琦、乔彩霞、杨承槐、吴丹、谷强。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T19915.6-2005 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪源链球菌通用荧光PCR检测方法。 本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪源链球菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件，其随后所有 的修改单不（包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的每方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3 缩略语 本标准采用下列缩略语： 荧光PCR 荧光聚合酶链式反应 Ct值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的闽值时所经历的循环圈数 DNA 脱氧核糖核酸 Taq酶 TaqDNA聚合酶 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 4 原理 采用TagMan方法，在比对猪源链球菌16SrDNA基因序列的基础上，设计针对该基因的特异性引 物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端‘标记FAM荧光素为报告荧光基团用（R表示）， 3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团用（Q表示），它在近距离内能吸收5端‘荧光基团发出的荧光 信号。PCR反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧 光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5-3的‘外切核 酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接 收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 5 猪源链球菌通用荧光PCR检测实验室的标准化设ti与管理 猪源链球菌通用荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438.1-2004中附录Co 6 试剂和材料 6.1 试荆 除另有说明，所用试剂均为分析纯。 6.1.1 无水乙醇：-20℃预冷。 6.1.2 75％乙醇：用新开启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌纯化水配制，-20℃预冷。 6.1.3 0.01mol/LpH7.2的PBS：配方见附录A,021士2)C,15min高压灭菌冷却。 GB/T19915.6-2005 6.1.4 猪源链球菌通用荧光PCR检测试剂盒，‘：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B, 6.2 仪器设备 6.2.1 高速台式冷冻离心机：最大转速 13000r/min以上。 6.2.2 荧光PCR检测仪、计算机。 6.2.3 2V-8℃冰箱和一20℃冰箱。 6.2.4 微量移液器：0.5p.L^-10tAL,5IAL-20pL,20p.L-2