不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长克隆与表达及分析.pdfVIP

不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与 表达分析 1,2 1∗ 2 王彦华 ，侯喜林 ，申书兴 1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095； 2 河北农业大学园艺学院，保定 071001 E-mail ：hxl@ 摘 要：以不结球白菜抗病自交系雪克青为实验材料，通过 RACE 技术，获得了不结球白 菜β-1,3-葡聚糖酶基因的 cDNA 全长序列。序列分析发现，该基因全长 1275bp，编码 363 个氨基酸，分子量为 40.66KD，等电点（pI）为 9.27。推导的氨基酸序列与芜菁 bg1基因 具有 96%的同源性，与拟南芥 bg2基因具有 61%的同源性，与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基 因的同源性为 49%-57%。Southern 杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于一 个。半定量 RT-PCR 分析表明，该基因有低水平的组成型表达，在霜霉病菌诱导后 24h 其表 达量达到高峰。将该序列提交 GenBank，登录号为 AY836001。 关键词：不结球白菜；霜霉病；β-1,3-葡聚糖酶基因；RACE；半定量 RT-PCR 不结球白菜(B. campestris ssp.chinensis)霜霉病是由专性寄生菌（Peronospor a parasitica Pers.Fr ）引起的一种病害，这种真菌性病害常引起幼苗和成株叶片枯黄，导致产量降低， 品质下降，选用抗病品种是解决这一病害的最有效途径。近年来，植物抗真菌病害基因工 程研究日益受到重视，已陆续找到了一些抗真菌蛋白，β-1 ,3-葡聚糖酶是研究最多、应用 最为广泛的抗真菌蛋白之一，其抗真菌具有广谱性、持久性的特点。目前，已从烟草、番 茄、拟南芥、水稻、大麦、小麦、玉米、马铃薯等植物中克隆了几十个 β-1,3-葡聚糖酶基 因（邢全华,王斌，2002 ），成为植物抗性改良基因工程中非常重要的基因资源。本实验室 在已经获得 的 β-1,3- 葡聚糖酶基 因 cDNA 片段的基础上（王彦华等，2004 ），采用 RACE( Rapid Amplification cDNA End)技术获得了其 cDNA 全长序列，并对该基因的拷贝 数及诱导表达规律进行了分析，为进行不结球白菜霜霉病抗病育种奠定了基础。。 1 材料和方法 1.1 材料 供试材料为不结球白菜抗病自交系雪克青，由南京农业大学白菜课题组提供。将不结 球白菜种子播种于装有灭菌基质的穴盘中，人工气候箱中按照光照 12h 、黑暗 12h 光周期， 20-25℃下培养。待幼苗长至两片真叶时接种霜霉病菌，于接种后 0h、12h、24h 、48h 和 基金项目： 高等学校博士点科研基金 （编号：20030307021 ） 作者简介： 王彦华（1970-），女，博士，副教授，E-mail：yhwang70@ * 通讯作者Author for correspondence(E-mail ：hxl@) - 1 - 72h 提取叶片总 RNA 。 大肠杆菌菌株 JM109 由本实验室保存；质粒载体 pMD 18-T、Taq DNA 聚合酶、限制 性内切酶、AMV 反转录试剂盒等均购自 TaKaRa 公司；Dig DNA Labeling and Detection Kit 购自 Roche 公司。 1.2 接种液制备及接种方法 参照程永安等（1995 ）的方法，从田间采回新鲜的不结球白菜霜霉病叶，流水冲洗， 刷掉表面老的子实体，在 17-20℃黑暗中保湿 24h诱发新的孢子囊。用湿棉球将新产生的孢