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生物技术实践 实验1 大肠杆菌的培养和分离 一.微生物的基础知识 1.微生物的定义 三.大肠杆菌的培养和分离实验流程 实验目的 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。 接种前准备 紫外灯和过滤风杀菌30min 用肥皂洗手并使用酒精消毒。 顺序：点燃酒精灯→酒精棉擦拭双手→酒精棉擦拭桌面 * 选修一 2.菌落 (1)定义 (2)作用 鉴定菌种的重要 依据 菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有一定形态结构等特征的子细胞的群落。 3.培养基 分类：1、固体培养基（分离、鉴定、计数、保存菌种） 液体培养基（扩大培养 工业生产） 半固体培养基 2、选择培养基与鉴定培养基 如伊红美蓝培养基，一般用于鉴定大肠杆菌（紫黑色，有金属光泽）。 培养基成分及其作用 主要来源 作用 成分 维生素，AA，碱基等 调节促生长 生长因子 水 调节渗透压等 无机盐 N2，NH3，铵，硝酸盐 尿素，牛肉膏，蛋白胨 合成含N类化合物 氮源 无机碳(CO2) 或有机碳(糖类) 主要作能源物质 碳源 二.灭菌操作 （1）定义：以化学剂或物理方法消灭所有微生物（包括芽孢和孢子）。 1、灼烧灭菌 2、高压蒸汽灭菌：100kPa、121 ℃下维持15min，培养基、无菌水等灭菌。具体见书P20 （2）方法： 1.煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2.巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃下煮15min（牛奶） 3.化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒（空气） （3）常用消毒的方法： 消毒与灭菌的区别： 消毒：较为温和的方法，消毒不能杀死芽孢 灭菌：强烈，所有微生物（包括芽孢和孢子） 配制培养基 包器材 灭菌 倒平板 接种扩大培养 分离 单菌落培养 三.大肠杆菌的培养和分离实验流程 制作LB培养基（液） 划线分离法 涂布分离法 倒平板技术 倒平板操作 接种过程 平板划线的操作方法 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 问题讨论 答：第一步灼烧是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 稀释涂布平板法