实验三 硝酸还原酶活性测定.pptVIP

NO2-含量测定（磺胺比色法） 在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。 取样前一天，用50mM KNO3加到培养小麦的水中，光照，以诱导硝酸还原酶产生。 两种材料[水(ck)，KNO3 (N)]各取2份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、擦干，剪成1cm小段，称取0.3克；将4份（ck、N）叶段分别置于含有10ml A、B溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管； 用纱网将材料压于液面以下，将试管放在真空干燥器中抽气30分钟，放气后摇晃直至叶段沉于溶液中； 将试管置于25～30℃温箱中，黑暗保温30分钟； 立即吸取1ml反应液，加入2ml磺胺试剂，摇匀，再加入2mlα-萘胺试剂（注意顺序），用漩涡仪混合摇匀，25 ℃水浴（水浴锅）反应5分钟, 取出后桌面静置10分钟，随后5分钟内，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照）。 取A液和B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂，作为对照管，在540nm测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照） 。 1） 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？ 2） NR酶活性（ NO2- ，uMol/h?gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h） 公式中的0.5 h 指哪一个？ * * 实验3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶（NR）活性的影响 硝酸还原酶 植物从土壤中吸收的NO3－必须经代谢性还原才能被利用，因为细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO3－中的N为高度氧化态。 硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)催化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。 诱导酶(induced enzyme):植物体本来不含有，但在特定外来物质(如底物)的诱导下,可以产生的酶。 受光促进 1. 实验目的意义 掌握硝酸还原酶活性的测定方法 了解硝酸还原酶的特性 硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。 硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2- ，其反应为： NO3- + NADH + H+ NO2- + NAD+ + H2O NR 在一定条件下，NO2-的生成量与NR的活性呈正相关，因此，可以通过测定NO2-的生成量来代表NR的活性。 2. 实验原理 （！不稳定，见光容易分解，测定需迅速。） 当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成直线关系。 NO2-含量标准曲线： [ NO2- ](μmol/ml) = 0.0026＋0.359OD540 NR活性(NO2- , μmol/h?gfw) = 鲜重(g)×时间(h) [NO2-] (μmol/ml)×稀释倍数 离体法：将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。 缺点：由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。 活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后被NR还原成NO2-，并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO2- 的含量即可得知NR的大小。 优点：不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件。 缺点: 重复性欠佳，应作一定量的重复。 硝酸还原酶活性测定 3. 材料与试剂 两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N） A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液: 0.2mol/L DNP (2-4-二硝基苯酚)溶液: 1mmol/L； 蔗糖溶液: 2.5mmol/L 磺胺试剂 α-萘胺试剂 4. 实验步骤 5. 结果与分析 [ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD540 NR活性（ NO2- , uMol/h?gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h） H2O KNO3 对照 处 理 A 液