SOD活性测定15914.docVIP

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。 超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。 一、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。 二、原理 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应： 由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片 2．主要仪器 （1）722型或其他型号的可见分光光度计 （2）万分之一分析天平 （3）高速冷冻离心机 （4）冰箱 （5）光照箱：4 500Lux （6）带盖瓷盘 1个/处理 （7）移液管架 （8）研钵 （9）离心管 5mL数个 （10）微烧杯 10～15mL 8个/处理 （11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1 （12）微量进样器 50μL×2；100μL×2 （13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL×1；1 000mL×2 （14）量筒 50mL×1；100mL×2 （15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2 （16）细口瓶 125mL×5 3．试剂 （1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液 A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4· 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 取上述A液183mL与B液17mL充分混