08第八章基因重组与分子生物学技术.ppt

第五节 基因工程与医学的关系 一、疾病基因的发现与克隆二、生物制药三、基因诊断四、基因治疗五、遗传病的预防 载体DNA与目的基因的连接 （二）人工接尾法 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得黏性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3‘-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行黏合，再由DNA连接酶连接。 （三）人工接头法 将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的黏性末端。 四、重组DNA的转化和扩增（转） 重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过转化（transformation）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌用CaCl2处理，增加细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒DNA短暂温育，质粒DNA即可导入宿主细胞。 如果是用λ噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染(transfection)方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。 重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。对于质粒DNA，还可通过在培养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色体DNA的复制，以单独扩增细胞中的质粒DNA。 五、重组DNA的筛选和鉴定（筛） 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行： ? （一）根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。 插入灭活法筛选重组体 （二）根据标志互补进行筛选 当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。 （三）根据DNA限制酶谱进行分析 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。 （四）用核酸杂交法进行分析鉴定 为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。 获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。 1.什么是基因重组技术？它包含那些内容？ 2.列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。 3.叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。 4.怎样获得目的基因或核酸序列的克隆？有那些 方法？要经过那些基本步骤？ 5.怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物？ 第三节 分子生物学常用技术 一、分子杂交与探针技术 （一）分子杂交 不同来源的单链核酸（DNA或RNA），只要它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋，这一现象称为分子杂交（molecular hybridization）。 利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 （二）探针技术 将已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记，然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。 二、分子印迹技术 印迹技术的原理首先由Edwen Southern在1975年提出。其基本操作过程是：将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳分离后，置NaOH液中浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链；然后将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，上面放上大量吸水纸巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置80℃烘干并使单链DNA分子固定在膜上，再用于分子杂交分析。因此，用于DNA印迹的技术又称为Southern Blotting或Southern 杂交。 分子印迹技术的种类