猪繁殖与呼吸综合征病毒orf7和orf5双基因的原核表达研究.pdfVIP

维普资讯 第 l9卷 5期 中 国 病 毒 学 19 (5)：476—480 2004年 lO月 VIR0L0GICA SD CA October 2004 猪繁殖与呼吸综合征病毒o,y-7和orf5双基因的原核表达研究 乐 敏，邱德新料，陈焕春，蒋增海 (华中农业大学动物医学院动物病毒室，湖北武汉 430070) ExpressionoftheCombinedorf7andorf5GenesofPorcineReproductiveand RespiratorySyndromeVirusinE．coli． YUEMin，QIUDe．xin ，CHENHuan．chun，JIANGZeng．hai (LabofAnimalVirology，CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070．China1 Abstract：AccordingtothenucleotidesequenceofPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus (PRRSV)，twopairsofprimersweredesignedandusedtoamplifiedhteorf7nadorf5genesbyRT-PCR， respectively．ByusinghteEcoRI、SpeInadHr／id IIIsites，boht geneswereclonedintopMD·18Tvector inturn，htensqeuencingnadcomparinghtehomologiesofhtecloninggenes．ThecombinedorfZnad off5geneswassubclonde intoaprokaryoticexpressingvectorpGEXK·G,hterecombinantplasmid namde pGEX ·KGNE wasconstructde na dtrna sformedintoE．coliBL21．Th eresultsofSDS·PAGEna d Western-b·lotindicatedhtathtecombinedgenesoforfZnadoff5nadGlutathionS··-·rtnasferase(GST) wasexpressde inE．coliBL21asafusionproteinGST-NE about64kDainmolecularweight，nadhtis fusion protein showde reactive activity immunologically．This study lays a foundation forhte developmentoftheserodiagnosticmehtodsnadvaccinesofrPRRSV． Keywords：Porcinereproductiveand respiratory syndromeviurs；orf7：orf5；Expressionoftwogenes inEcoli． 摘要：根据PRRSV已知序列设计两对引物，采用 RT-PCR方法分别扩增orf7和 orf5基因片段。利用EcoRI、Spe I和HindIII位点将orf7和orf5基因片段依次克隆到pMD一18T载体，构建成重组质粒pMD18NE，并比较所克隆 基因序列的同源性。将串联的off／和 orf5基因亚克隆到原核表达载体 pGEX．KG，构建重组原核融合表达质粒 pGEX．KGNE，并转化BL21，SDS．PAGE和Western．blot分析表明：off7和orf5基因与GST获得了融合表达，并 且表