硕士学位论文猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子基因在毕赤酵母中的表达研究.docVIP

硕士学位论文 猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子基因在毕赤酵母中的表达研究 目录 摘要……i Abstract……111 缩略词表……v 一、前言……1 1.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子研究进展……1 1.1粒细胞巨噬细胞集落刺激因子历史背景……1 1.2粒细胞巨噬细胞集落刺激因子生物学特性……2 1.3粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的应用……5 1.3.1作为DNA疫苗佐剂……5 1.3.2GM一CSF的临床应用……5 2.巴斯德毕赤酵母表达系统研究现状……7 2.1宿主菌……7 2.2表达载体种类……8 2.3巴斯德毕赤酵母中外源蛋白的表达……8 2.3.1巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达特点……8 2.3.2巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达水平……9 2.4糖基化对外源蛋白结构与功能的影响……‘……n 2.5应用前景及展望……n 3.TF一1细胞研究概况……，……12 4.本研究目的与意义……12 二、实验部分……14 1.材料……，……，……‘……14 1.1菌株与载体……14 1.2主要试剂……14 1.2.1自备试剂……14 1.2.2生物学试剂……，.14 1.3主要仪器……，……15 2.方法……，……16 2.1引物设计……16 2.2pGM一CSF基因的扩增及回收……16 ;四川农业大学硕士学位论文 2.2.1PCR扩增模板19T-GM质粒抽提……16 2.2.2pGM一CSF基因的PCR扩增……17 2.2.3pGM一CsF基因的回收……18 2.3pGM一CsF基因的克隆及鉴定……18 2.3.1DH5a感受态细胞的制备……、...……18 2.3.2pGM一CSF连接及转化……、...……19 2.3.3阳性转化子的鉴定……20 2.4毕赤酵母表达载体pPICgK一pGM的构建及鉴定……21 2.4.1pMD19一T-pGM基因酶切及回收……21 2.4.2连接及转化……‘············……21 2.4.3阳性转化子的鉴定……21 2.5重组表达载体pPICgK一pGM质粒的转化……22 2.5.1毕赤酵母感受态细胞的制备……22 2.5.2重组表达载体线性化……22 2.5.3线性化载体质粒的电转化……23 2.6毕赤酵母重组子GSlls币PICgK一pGM的筛选与鉴定……24 2.6.1高拷贝重组子的抗性筛选……，……24 2.6.2Mut+和Muts表型鉴定……，……24 2.6.3重组子PcR鉴定······················……25 2.7Gsl15币PICgK一pGM的诱导表达产物的间接EuSA分析检测……26 2.7.1GSll5/PPICgK一pGM的诱导表达……26 2.7.2诱导表达时间的优化……26 2.7.3GSll5/PPICgK一pGM的诱导表达产物的间接ELISA检测……26 2.8GSlls币PICgK一pGM诱导表达产物的SDS一PAGE检测……27 2.8.1三氯乙酸沉淀样品……27 2.8.2sDs一PAGE检测······························……27 2.9Gsll5币PlcgK一pGM的诱导表达产物westernblotting鉴定……28 2.10GSlls币PICgK一pGM的诱导表达产物活性检测……28 3结果……29 3.1pGM一CSF基因扩增结果……29 3.2pGM一CSF基因克隆及鉴定……，……29四川农业大学硕士学位论文 3.2.1pGM一CSF克隆载体的PCR和酶切鉴定……29 3.2.2pGM一CSF克隆载体序列分析……30 3.2.3pGM一CSF氨基酸序列分析结果……30 3.2.4pGM一CSF二级结构预测分析结果……31 3.2.5pGM一CSF三维结构预测结果……31 3.2.6pGM一CSF同源性比较与遗传进化分析结果……犯 3.2， 7pGM一CSF蛋白糖基化位点预测分析……33 3.3毕赤酵母表达载体pPICgK一pGM的构建及鉴定……33 3.4毕赤酵母重组子 Gslls/PPlcgK一pGM的筛选与鉴定……:.34 3.4.1高拷贝重组子的抗性筛选……34 3.4.2Mut+和Mut，表型鉴定……34 3.4.3重组子PCR鉴定……35 3.5GSll5/PPlcgK一pGM诱导表达产物的间接ELIsA分析……35 3.6GSlls币PlcgK一pGM的诱导表达产物sDs一队GE分析……37 3.6.1初步诱导表达……37 3.6.1诱导时间的优化······························……37 3.7GSll5币PICgK一pGM的诱导表达产物westem一blotting分析……38 3.8GSll