《植物细胞组织培养》实验指导.docVIP

T 植物细胞组织培养技术 实验指导书 中国计量学院生命科学学院 二零零六年七月 《植物细胞组织培养》实验指导 目 录 实验一、植物组织培养培养基母液的配制 实验二、植物组织培养的培养基配制 实验三、康乃馨的离体快繁 实验四、胡萝卜愈伤组织的建立 实验五、组织培养物的继代培养 实验一 组织培养基母液的配制 一、 仪器及药品 冰箱、天平（0.0001g） 容量瓶: 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、25 ml 广口储液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml 烧杯：1000 ml 、500 ml 、250 ml、100 ml 、50 ml 数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺 标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1 mol/L盐酸、1 mol/L NaOH 几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品 蒸馏水 二、方法和步骤： 按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下： 大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1 L培养基需吸取该母液l00 ml或50 ml。 微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成 100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1 L N6培养基需吸取该母液10 ml或者1 ml。 铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4?7H2O）2.78 g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73 g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1 L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N6培养基需加该铁盐母液5 ml。 有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。 植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、 萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）；细胞分裂素类：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）。配制时需要单个称量，根据需要可分别用酸、碱或酒精等不同的溶剂溶解后 ,再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每ml含 0.1-2 mg，配制培养基时按所需要的量分别加入，本实验中的2,4-D和6-BA均配成1 mg/ml的母液。 在配制吲哚乙酸（IAA）母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏水定容，否则会发生沉淀。而配制6-BA母液时，要用少量的1 mol/L NaOH溶解；而配制2,4-D时，可先用少量的95%酒精溶解。 表1 N6 朱至清(1975)培养基配方 药品名 配方量(mg/L) 母液倍数 称取量(g/L) (NH4)2SO4 大量元素 463 10× 4.63 KNO3 2 830 28.3 CaCl2·2H2O 166 1.66 MgSO4·7H2O 185 1.85 KH2PO4 400 4.0 Na2- EDTA 铁盐 37.3 100× 3.73 FeSO4·7H2O 27.8 2.78 MnSO4·4H2O 微量元素 4.0 1000× 4.0 ZnSO4·7H2O 3.8 3.8 H3BO3 1.6 1.6 KI 0.8 0.8 盐酸硫胺素(VB1) 有机物质 1 1000× 1.0 烟酸 0.5 0.5 盐酸吡哆醇(VB6) 0.5 0.5 甘氨酸 2.0 2.0 各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制1 L培养基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中储存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。 三、注意事项 1. 如药品所带结晶水不同，应进行换算。 2. 因常用的MS培养基中硝酸铵(NH4NO3)属于公安部门严格限制管理的药品，所以本实验采用N6培养基替代MS培养基。 实验二 培养基的配制 一、仪器设备及试剂 电炉 天平（0.0001 g） 高压灭菌锅 量筒：l0 ml、20 ml、100 ml、500 ml 烧杯：1000 ml、500 ml、250 ml 移液管：1 ml、2 ml、 5 ml 吸管若干、记