4PCR研究方法-3.ppt

PCR技术 内容提要: 一、PCR技术原理 很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一 Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…... 一、PCR技术原理 聚合酶链式反应(PCR) : 引物的化学本质是什么？ 单链寡核苷酸DNA或RNA片段。 PCR原理 PCR (Polymerase Chain Reaction):聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 其基本原理是依据DNA半保留复制以及DNA变性和复性原理，通过控制反应温度，耐高温的DNA聚合酶以单链DNA为模板，以dNTP为原料，使引物沿单链模板延伸合成双链DNA。 高温变性，低温退火，适温延伸三个步骤，使目的DNA片段得以迅速扩增。 （一）PCR基本过程 1. PCR循环由三步组成： PCR技术原理 PCR技术原理 PCR技术原理 PCR技术原理 PCR技术原理 PCR技术原理 在模板DNA、引物、4种dNTP存在条件下，依赖DNA 聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。 3. PCR扩增终产物大小: 介于两条退火引物5′末端之间的双链DNA片段。 4.什么叫引物延伸产物？ 比两引物限定区长的延伸产物。仅发生在以原始模板DNA为模板的扩增过程中，以倍数形式扩增(2n)。 （二）平台期与平台效应 1. 平台效应（plateau effect）： PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入静止期即平台期。 PCR平台效应 二、耐热DNA聚合酶 （三）高保真的耐热DNA聚合酶 （一） PCR耐热DNA聚合酶的发现 （二）Taq DNA聚合酶 从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。 1.较高的热稳定性 ● 95℃的半衰期: 40 min ● 最适温度: 72 ℃ ～80 ℃ ● 催化反应速率: 150～300核苷酸 / 秒/ 酶分子 Taq DNA聚合酶特性： ● 5′→3′聚合酶活性； ● 5′→3′外切酶活性； ● 逆转录酶活性； ● 较弱的非模板依赖性； ● 缺乏3′→5′外切酶活性。 2. 无机离子及抑制剂 Taq DNA聚合酶的活性对Mg 2+ 浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。 3. 保真性 如何提高PCR DNA聚合酶的保真性？ ① 使用Taq DNA聚合酶时，掺入少量具有3′→5′外切酶活性的耐热DNA聚合酶,错配率可降为原来的1/10； ② 使四种dNTP底物浓度相等； ③ MgCl2浓度尽可能低； ④ 减少循环数。 （三）几种高保真的耐热DNA聚合酶 1. Tth DNA聚合酶 2. Vent DNA聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶 三、PCR引物及设计原则 （一）引物设计原则 （一）引物设计原则 引物序列及其与模板特异性结合是决定PCR反应结果的关键。 1.引物设计原则: ① 引物长度: 10～30 Nt 简并引物设计及应用： ① 对纯化的未知蛋白测定一段短 氨基酸序列。 ②不同物种某一基因编码的保守 氨基酸区域。 4.优化的引物设计实例 上游引物序列： 5′GAGAACATGGTGCGCAGGTT 3′ 下游引物序列： 5′TGCCCATCATCATGACCTGG 3′ 5′ CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG