Chapter5固定化技术及其应用.docVIP

Chapter 5 固定化应用 Section 1 固定化 1、发展历史： 1953年，德国的格鲁布霍费（Grubhofer）和施莱思（Schleith）首次制成固定化酶。 ~1973年，日本的千畑一郎首次在工业生产上连续生产L-氨基酸、L-天冬氨酸，开创了固定化酶和固定化微生物细胞应用于工业生产的先例； 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精。 1978年，日本固定化枯草杆菌细胞生产α-淀粉酶的研究取得成功。1986年，我国用固定化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶，用谷氨酸棒杆菌原生质体生产谷氨酸脱氢酶。 固定化细胞和固定化原生质体以酶等各种代谢产物的生产为目的，可以代替游离细胞进行酶的发酵生产，具有提高产酶率、缩短发酵周期并可连续发酵生产等优点，。 现状 在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。 Section 酶固定化酶的稳定性较差酶的一次性使用分离纯化困难固定化酶（Immobilized Enzyme）：固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。 酶的固定化：采用各种方法，将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。 一制备方法 1）吸附法（adsorption）：利用各种固体吸附剂将酶吸附在其表面上固定的方法是固定化中最简单的方法。可分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法physical adsorption）：是制备固定化酶最早采用的方法。 离子吸附法ion adsorption）：通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。常用载体有DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、CMC等。吸附容量一般大于物理吸附法。 2）包埋法（entrapment）：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。 ◆ 凝胶包埋法常用的载体有天然凝胶合成凝胶或树脂等。 微胶囊包埋法 结合法(binding）：交联法（cross-linking）：借助双功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。应用最广泛的双功能试剂是戊二醛。 （二固定化酶的 1、优点：1）无需进行酶的分离纯化，大大降低成本；2）提高了酶的稳定性和对污染的抵抗力；3）细胞生长停滞时间短，反应快。 2、缺点：1）固定化酶的活力有所损失2）必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶；3）载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍。 Section 细胞的固定化固定化细胞：固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。 细胞的固定化：采用各种方法，将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程。 细胞固定化方法：吸附法、包埋法 （一）固定化微生物细胞的特点 保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好可按照 2、发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。 密度提高，可以提高产率。 固定化细胞的特点 由于 2、细胞被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。 可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高 4、易于与培养液分离，利于产品的分离纯固定化细胞的特点 由于有载体的保护作用，可 2、动物细胞固定化后，可先在生长培养基中生长繁殖，使细胞在载体上形 3、可反复使用或连续易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。 Section 原生质体固定化 固定化原生质体的制备主要包括原生质体的制备和原生质体固定化两个阶段。 一、原生质体的制备 将对数生长期的细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。然后加入适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，而得到原生质体。 要进行原生质体固定化，必须将微生物细胞和植物细胞的细胞壁破坏而分离出原生质体。同时要在破坏细胞壁的时候，不能影响到细胞膜的完整性，更不能使细胞内部的结构受到破坏，为此只能使用对细胞壁有专一性作用的酶。细菌原生质体制备时主要采用从蛋清中得到的溶菌酶；酵母细胞壁采用13-葡聚糖酶；霉菌的细胞壁需有几丁质酶与其他有关酶共同作用植物细胞壁应用纤维素酶和果胶酶。 二、原生质体固定化 原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。 原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等。 固定化原生质体具有下列特点。 ①由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和