拟态弧菌模拟表位的串联表达及其草鱼的免疫应答研究.pdfVIP

- I - II 摘要 拟态弧菌可引起水产动物的腹水病，严重危害水产养殖业的健康发展，但目前尚 无疫苗用于该病预防。本实验室前期研究已证实外膜蛋白U（OmpU）是拟态弧菌保 守性黏附素蛋白之一，该蛋白对实验小鼠的免疫保护率为60%。同时，筛选鉴定出 OmpU 6 B 蛋白的 个免疫优势 细胞模拟表位，但模拟表位串联肽的免疫效应尚不清 楚。本研究的总体思路是设计和表达OmpU蛋白模拟表位串联肽，综合评价其免疫 效应，以期获得免疫保护效应较OmpU蛋白有所提高的多表位肽。 首先，根据OmpU蛋白模拟表位序列及多表位串联肽设计原则，优化设计模拟表 位串联肽。即用AAY（丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸）接头将已鉴定获得的OmpU 蛋白6 个模拟表位按不同方式串联，应用DNAStarProtean 软件分析各种串联方式的可行性， 结果发现以C25-AAY-C17-AAY-C60-AAY-C20-AAY-C66-AAY-C24方式排列的多表位 肽中各表位间相对独立，抗原性参数较好，为最佳串联方式。将此多表位串联肽序列 转化为基因序列，并在基因序列两端添加酶切位点，终止密码子以及替换稀有密码子， 形成一个长度为264bp的多表位串联基因（命名为6epis基因），委托生物公司克隆至 质粒pMAL-c4X中。 其次，大量制备模拟表位串联肽，为综合评价其免疫效应提供试验材料。应用基 因重组技术构建重组表达质粒pET-32a-6epis，转化至E.coliRosetta 进行大量诱导表 达，进而使用Ni-Charged Resin 亲合层析柱纯化重组蛋白His-6EPIS。经SDS 和Western-blot 分析，发现制备的重组蛋白浓度为1.5mg/mL，纯度达到95%，能与 兔抗OmpU抗体发生特异性反应，仍保留天然蛋白的抗原性。 最后，以制备的重组模拟表位串联蛋白、重组OmpU蛋白、标签蛋白和灭活菌 苗分别免疫实验鱼，通过测定免疫器官中免疫相关基因表达水平、血清抗体产生水平 1 6EPIS 和免疫动物的保护水平，综合评价其免疫效应。结果显示：（ ） 免疫组草鱼头 肾和脾脏中IgM mRNA的表达水平具有明显时间依赖性，免疫后3d开始逐渐升高， 至28d达到高峰，攻毒后头肾和脾脏中IgM mRNA表达水平迅速上升，分别较免疫 28 54 (p0.01) OmpU 前提高 倍和 倍 。 组、灭活菌组和标签蛋白组草鱼免疫后组织中 IgM mRNA转录水平的动力学与重组6EPIS组相似，两因素方差分析结果表明：重 组6EPIS组头肾和脾脏中IgM mRNA转录整体水平均显著高于重组OmpU组、灭活 His p0.05 OmpU His 菌组和 标签蛋白组的头肾和脾脏（ ），而重组 组、灭活菌组和 标签蛋白组的IgM mRNA转录整体水平无显著差异（p0.05）。（2）草鱼头肾和脾脏 中促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）mRNA表达水平于首次免疫和加强免疫后的第1d 上调至极显著水平(p0.001)，但攻毒后的表达水平与对照组差异不显著(p0.05)。重 - I 组6EPIS组促炎细胞因子的整体转录水平显著高于重组OmpU组、灭活菌组和标签 蛋白组(p0.01)，且重组OmpU组和灭活菌组均显著高于标签蛋白组(p0.01)，但两 组之间差异不显著(p0.05)。（3）免疫草鱼脾脏和头肾中抗炎性细胞因子IL-10mRNA 表达水平轻微下调，但在攻毒后，表达水平显著上调 (p0.01)，6EPIS 组、OmpU组、 灭活菌组促