质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定.docxVIP

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质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定[实验目的]训练学生正确使用加样器;了解限制性内切酶及酶切条;学会分析质粒DNA的酶切图谱;系统掌握琼脂凝胶电泳的基本技术。[实验原理]限制性内切核酸酶(也可称限制性内切酶)是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内同时存在一对酶,分别为限制性内切酶(限制作用)和DNA甲基化酶(修饰作用)。它们对DNA底物有相同的识别顺序,但生物功能却相反。由于细胞每存在DNA甲基化酶,它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化,就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏,而对感染的外来噬菌体DNA,因无甲基化而被切割破坏。所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士,它与DNA甲基化酶一齐构成了保护自己、抵抗外源入侵的DNA防御机制。目前已发现的限制性内切酶有数百种。EcoRⅠ和Hind Ⅲ都属于Ⅱ型限制性内切酶,这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子的特异核苷酸顺序的能力,能在这个特异性核苷酸序列内,切断DNA的双链,形成一定长度和顺序的DNA 片断。EcoRⅠ和Hind Ⅲ 的识别序列的切口是:EcoRⅠ: G↓AATTC Hind Ⅲ: A↓AGCTT G,A等核苷酸表示酶的识别序列,箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口,就能产生多少个酶切片段,因此鉴定酶切后的片断在电泳凝胶中的区带数,就可以推断酶切口的数目,从片断的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子质量的线状DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。[实验器材]1.仪器和材料电泳仪、电泳槽,样品槽横板(梳子),有机玻璃内槽,橡皮膏,锥形瓶(100mL或50mL),玻璃纸,一次性塑料手套。pUC19(市售和自提),EcoRⅠ酶,λDNA- Hind Ⅲ酶切的分子量标准、琼脂糖。2.试剂(1)TAE缓冲液(1×TAE):称取Tris 4.9g、EDTA-Na2-2H2O 0.74g,用900ml蒸馏水分别溶解后,添加冰醋酸1.14ml,最终用蒸馏水定容至1L。(2)酶反应终止液(10×):两种反应终止液可供选择。①0.1mol/L EDTA-Na2,20%FiCoLL,适量橙G。②0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF(或称二甲苯蓝),40%蔗糖水溶液(m/V)(或用30%蔗糖水溶液)。[实验步骤]1,质粒DNA的酶解 ?编号?1?2?3?4?5?6?市售的pUC19(微升)?0?0?3?3?0?0?自提的pUC19(微升)?6?6?0?0?6?6?EcoRⅠ(微升)?2?0?2?0?2?0?Buffer 5×2?2?2?2?2?2?H2O/(微升)?0?2?35?0?2?总体积/(微升)?10?10?10?10?10?10质粒DNA酶解的反应成分及加样量2,琼脂糖凝胶板的制备 (1)琼脂糖凝胶的制备:称取0.14g琼脂糖,置于蓝盖试剂瓶中,加入20ml TAE缓冲液,置于高压灭菌锅内加热,锅内压力为至121kPa时维持10min,琼脂糖即可全部融化在缓冲液中,取出摇匀,则为0.7%琼脂糖凝胶液。(2)胶板的制备:取有机玻璃内槽,洗净、晾干。(3)放好样品加样孔合适的梳子。(4)将冷却至65度左右的琼脂糖凝胶液,小心地倒在有机玻璃内槽上,控制灌胶速度,使胶液缓慢地展开,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右。(5)待凝胶完全凝固后,将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽内备用,加入足量电泳缓冲液。(6)轻轻拔出梳子。3,加样(1)预先染色DNA(2)用微量加样器将样品加入胶版的样品小槽内,加样时枪头垂直于样品槽上方,注意不能碰到样品槽的凝胶面。(3)每次加完一个样品,及时更换枪头,以防止相互污染。加样时,应防止碰坏样品槽周围的凝胶面。4,电泳正确连接正负极,DNA向正极移动。 加完样品后的凝胶板立即通电,进行电泳。但要注意控制一定的条件,样品进胶前,应使电流控制在30mA,样品进胶后电流为30mA。当橙G或溴酚兰染料移动到距离胶板下沿约1~2cm处,停止电泳。5,拍照观察[实验结果][结果分析]

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