含NURR1基因腺病毒对神经干细胞分化的影响.pdfVIP

含NURR1基因腺病毒对神经干细胞分化的影响1 1 2 2 1 2 李庆军 ，黎祥喷 ，刘军 ，赵东晖 ，邢诒刚 1 广东东莞市人民医院 东莞 523003 2 中山大学附属第二医院神经内科 广州 510130 摘 要：目的 含NURR1 基因的重组腺病毒对神经干细胞分化的影响。方法 免疫组化观察转染 腺病毒后C1712 神经干细胞后分化效率。结果 含NURR1 基因的重组腺病毒可使C1712 神经干细 胞分化后近76 %细胞表现为神经元显型。结论 含NURR1 基因的腺病毒能明显的提高神经干细胞 的分化效率。 关键词：帕金森病; 神经干细胞; 腺病毒; NURR1 神经干细胞具有多向分化潜能, 在适当的条件下能分化为多巴胺能神经元, 因此移植或激 活体内已存在的神经干细胞,补充体内缺失的多巴胺能神经元, 恢复多巴胺能神经元的神经支配, 是治疗PD 的最佳选择[1] 。NURR1 基因在1992 年被美国贝尔医学院细胞生物研究所发现并克 隆, NURR1 主要表达在腹侧中脑多巴胺能神经元, NURR1 与黑质多巴胺能的体细胞向多巴胺 能神经元方向分化及多巴胺能神经元发育、成熟、迁移和生存有密切关系[2] 。Wagner[3]等在实 验中发现将表达NURR1 基因的质粒转染神经干细胞后, 可在体外被诱导分化为神经元细胞显 型, 在与1 型胶质细胞共培养下可分化为多巴胺神经元的特性。由于质粒转染效率低、表达时 间短和表达量低, 转染质粒时所需的脂质体对细胞的毒性, 以及质粒调控神经干细胞分化效率 较低, 因此单靠含NURR1 基因质粒转染神经干细胞后进行移植治疗PD 难以满足基础研究和 临床需要。因此, 本实验在构建含Ad - NURR1 重组腺病毒(Adenoviruswith NURR1 gene , Ad - NURR1) 载体后, 研究NURR1 基因对神经干细胞分化为神经元显型的影响。 1 材料与方法 111 主要试剂和仪器 含Ad - NURR1 重组腺病毒本实验室已成功构建。NSE 抗体购自 Chemicon 公司, nurrl 抗体、DAB 试剂盒购自武汉博士德公司, 余化学试剂均为国产或进口分 析纯级试剂。 112 Ad - NURR1 重组腺病毒对C1712 神经干细胞分化的影响 11211 C1712 神经干细胞传代: 将C1712 神经干细胞(美国哈佛医学院胞Snyder 教授所赠) 接种于含10 %胎牛血清、5 %马血清DMEM/ F 12 培养基中培养传代。将Ad - NURR1 重组腺病 毒以MOI = 20 加入细胞上清液内, 约6h 后收集转与未转腺病毒的细胞, 用无血清培养液稀释, 滴加在用多聚赖氨酸处理过的盖玻片上, 荧光显微镜下观察Ad - NURR1 腺病毒在C1712神经 干细胞内表达, 培养72h , PBS 冲洗后用含4 % 的多聚甲醛进行固定。 11212 免疫组化分别检测nurrl 、NSE 抗原和nurrl 、NSE 阳性细胞比例: 将固定后的细胞 爬片用H2O2 灭活内源性过氧化物酶,PBS 冲洗, 滴加一抗, 4 ℃过夜, 依次滴加生物素化二抗、 SABC , DAB 室温显色。流水冲洗过夜, 干燥后封片, 计算nur2rl 、NSE 染色阳性细胞比例。 1基金项目: 由国家教育部博士点基金资助, 编号D002003003 。 -1-