2013第三章基因的克隆与分离.pptVIP

第三章 基因的克隆与分离 目的基因的定义 第四章 目的基因获取 第一节 直接分离法 第四章 目的基因获取 ① 载体的制备； ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取； ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑取和保存。 文库的代表性和随机性 文库的质量检测 亚基因组文库 指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合，一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆等）。 cDNA文库的构建 1、cDNA文库的特征 1）基因表达的时空性决定cDNA文库的取材， 构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的 发育时期或这一时期的特殊组织。 2）表达量的差异决定构建cDNA文库要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的49% 低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA的29% 2、均一化cDNA文库 通过一定的策略和方法，将构建好的独立cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种cDNA文库称均一化cDNA文库。 获得目的基因的其他方法 ㈠ 构建差示文库筛选特殊基因 差示文库（differential library）又称扣除文库（ subtracted library）, 是反映不同组织细胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差异的cDNA文库。 ㈡ mRNA差异显示法获得目的基因 mRNA差异显示（mRNA differential display DD）PCR法全称为DD-PCR法其用途和应用目的与构建差示文库大体一致。 ㈢ 基因改造可获得新型目的基因 采用基因拼接、基因缺失或点突变等方法，使表达产物量提高或降低毒性，有助于研究基因间的相互作用（如协同／抑制效应）。 第二节??????? 获得目的基因方法的选择 一、根据获得目的基因的研究目的选择方法 为了研究基因全长结构、调控、DNA信息分析 构建基因组文库， 为了开展目的基因重组表达 制药、治疗 构建cDNA文库。 若目的基因序列明确可设计引物通过PCR/RT-PCR克隆。 若目的基因序列短小可化学合成。 二、根据目的基因本身特点选择方法 对从基因组中克隆的基因(内含子) 只能真核表达 对从cDNA中克隆的基因(无内含子) 可在原核/真核表达 要选择mRNA表达丰富的组织材料，PCR克隆的基因必须测序。 三、根据实验室设备条件选择方法 部分文库无需自行构建，有商品出售。 目的基因序列明确，也无需建库，可直接用PCR/RT-PCR克隆。 第四章 目的基因获取 一 利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。 二、对所找到的序列进行多序列比对 将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线分析http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。 三、确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。 四、利用软件设计引物 当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条