褐黄孢链霉菌基因组DNA的提取及RAPD体系的优化.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（６ｓ）：１７２～１７７ 褐黄孢链霉菌基因组ＤＮＡ的提取及 ＲＡＰＤ 体系的优化  刘　丹　骆健美 　刘　峰　王　敏 （天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室　天津　３００４５７） 摘要　以改进的ＳＤＳ法提取褐黄孢链霉菌基因组ＤＮＡ，对其进行随机扩增多态性（ＲＡＰＤ）研究。 通过单因素和正交试验相结合的方法，建立了适于褐黄孢链霉菌ＲＡＰＤ分析的ＰＣＲ反应体系：包 ２＋ 括Ｔａｑ聚合酶、Ｍｇ 、随机引物、ｄＮＴＰｓ和模板浓度。在２０ｌ体系中，模板ＤＮＡ浓度６０～１５０ｎｇ， μ ２＋ Ｔａｑ聚合酶为１．０～１．５Ｕ，引物浓度０．３～０．４ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ浓度２００～２５０ｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ 浓度２．５ μ ～３．０ｍｍｏｌ／Ｌ。在此反应体系下可扩增出条带数目多且清晰稳定的电泳图谱。 关键词　褐黄孢链霉菌　ＤＮＡ提取　ＲＡＰＤ优化 中图分类号　Ｑ９３９．９２ 　　纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗生素，对酵母， 因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，电泳分离后直接检测其多态 霉菌和丝状真菌具有明显的抑制作用，抑菌谱系广泛， 性。ＲＡＰＤ技术可以在不知道物种任何分子生物学背 但无抗细菌活性。所以纳他霉素作为一种天然的生物 景下，对其进行 ＤＮＡ多态性分析，扩增所需模板 ＤＮＡ 食品防腐剂可以广泛应用于易受真菌污染的食品工业 用量少，对 ＤＮＡ的纯度要求也不高，操作简便、快速。 ［１］ 各领域 。本课题组曾将纳他霉素制剂应用于苹果和 目前已广泛应用于遗传多样性检测、种质纯度鉴定、起 葡萄贮运期病害的抑制研究，取得了很好的效果［２，３］。 ［６］ 源进化研究、基因定位、遗传连锁图谱构建等方面 。 但是由于纳他霉素的产量很低，造成纳他霉素产品成 鉴于此，本文对褐黄孢链霉菌基因组ＤＮＡ的提取方法 本很高，限制了其应用。目前，对纳他霉素产生菌的研 及适于ＲＡＰＤ分析的ＰＣＲ反应体系进行了系统的优 究多停留在发酵方面，应用分子生物学的方法进行改 化，为进一步采用ＲＡＰＤ技术探究褐黄孢链霉菌生物合 造对提高纳他霉素产量有很大的意义。褐黄孢链霉菌 成纳他霉素的基因表达研究和功能分析奠定了基础。 （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｉｌｖｏｓｐｏｒｅｕｓ）作为纳他霉素的一种产生菌， 其生活周期（包括分化及孢子形成等）和次级代谢网络 １　材料与方法 非常复杂。目前世界上对褐黄孢链霉菌生物合成纳他 １．１　供试菌株 霉素的研究还不是十分深入，关于其具体分子遗传机 　　褐黄孢链霉菌：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｉｌｖｏｓｐｏｒｅｕｓ（由本实验 制还有待进一步深入研究。 室保存） 　 　 随 机 扩 增 多 态 性 ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ １．２　主要试剂及仪器 ［４］ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）是由Ｗｉｌｌｉａｍｓ等 和Ｗｅｌｓｈ