化学合成siRNA阻断小鼠骨髓源性不成熟树突状细胞GAPDH的表达.pdfVIP

化学合成化学合成 siRNAsiRNA 阻断小鼠骨髓源性不成熟树突状细胞阻断小鼠骨髓源性不成熟树突状细胞 化学合成化学合成 siRNAsiRNA 阻断小鼠骨髓源性不成熟树突状细胞阻断小鼠骨髓源性不成熟树突状细胞 11 11 GAPDHGAPDH 的表达的表达 GAPDHGAPDH 的表达的表达 蔡端，顾晓冬，项建斌，陈宗佑 复旦大学附属华山医院外科，上海 （200040） E-mail ：xjbzhw@ 摘要摘要：：目的 观察化学合成siRNA在转录后水平即mRNA水平降低小鼠不成熟树突状细胞基因 摘要摘要：： 表达的效率，并对其影响因素进行初步探讨。方法 体外取小鼠胫骨和股骨的骨髓，分离、 培养不成熟树突状细胞，应用化学合成的不同浓度siRNA在LipofectAMINE 2000转染试剂介 导下转染树突状细胞，流式细胞仪检测siRNA的转染效率，RT-PCR检测小鼠不成熟树突状 胞中GAPDH mRNA水平的变化，台盼蓝染色测定各组中培养细胞的存活率。结果 脂质体能够 将化学合成siRNA转入树突状细胞中，转染终浓度为100～600nmol/L的siRNA能特异有效地 阻断GAPDH的表达，而转染终浓度为50～400nmol/L的siRNA有利于细胞存活。结论 siRNA能 在不成熟树突状细胞内启动RNA干扰作用，适宜浓度的siRNA能在特异有效地阻断内源性基 因表达的同时，最大限度地保持细胞活力。 关键词关键词：：siRNA；树突状细胞；GAPDH；RNA干扰 关键词关键词：： 中图分类号中图分类号：：R657.3 中图分类号中图分类号：： 1.引言1.引言 1.1.引言引言 近年来的研究表明，一些短片段的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）可以通过 促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基 因缺失的表型，称为RNA干扰[1] （RNA interference，RNAi）。小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）就是这种短片段的dsRNA，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标， 降解特定的mRNA，从而抑制相应基因的表达。尽管RNAi在非哺乳动物细胞和部分哺乳动物 细胞系中能有效发挥作用，RNAi在骨髓源性不成熟树突状细胞 （dendritic cell，DC）内 能否有效短暂地降解目的基因的表达，目前还不清楚。不成熟DC表面缺乏共刺激分子,不能 有效的刺激幼稚T细胞，反而使T细胞功能失活，并可诱导同种异体抗原特异性T细胞的低反 应。利用RNAi阻断DC表面共刺激分子的表达能否产生这种抑制性DC[2] ，目前也不清楚。为此， 本实验通过体外分离培养C3H小鼠骨髓来源的不成熟DC，然后应用化学合成siRNA转染不成 熟DC，观察siRNA是否能阻断细胞中参与糖酵解的甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的表达，并对其相应的机制进行 初步探讨。 2.材料与方法2.材料与方法 2.2.材料与方法材料与方法 2.1 实验动物和试剂2.1 实验动物和试剂 2.1 2.1 实验动物和试剂实验动物和试剂 7～9 周龄健康 C3H 小鼠 （H-2k），重约 25g，雌雄不限，购自中国科学院上海实验动物 中心。红细胞裂解液、胎牛血清、FACS洗涤液和 FACS 固定液由上海交通大学医学院免疫研 究所提供。RPMI 1640不完全培养液和不含血清的Opti-MEN I 培养液购自 GIBCO 公司。RPMI 1 本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金 （20030246069 ），国家自然科学基金 ）资助