鸡恒定链P31基因及其点突变体在真核细胞中表达与定位特性.pdfVIP

鸡恒定链P31基因及其点突变体在真核细胞中表达与 定位特性1 李林，仲大莲，余为一 安徽农业大学安徽省人兽共患病重点实验室，合肥（230036 ） E-mail：yuweiyi@ 摘 要：为研究鸡恒定链(invariant chain,Ii)分子免疫调节功能及其机理，用两对引物通过PCR 从PMD18-T/Ii P31质粒中扩增出鸡Ii的 P31基因,将该基因分别插入真核表达载体pEGFP- N1 和pEGFP-C1 中，构建成N1-P31和C1-P31质粒。另设计四条突变用引物，利用大引物突变的 方法，经两次点突变，构建成C1-P8-18A质粒。经双酶切鉴定和测序鉴定后,将这三个质粒分 别转染人293细胞，经48h培养后用荧光显微镜检测。结果表明, 重组质粒N1-P31和C1-P31 转染的细胞荧光主要出现在胞浆区的细胞器内，而由C1-P8-18A、pEGFP对照转染的细胞中 绿色荧光则主要分布在胞核，这说明融合蛋白ChIi-GFP或GFP-ChIi 中鸡Ii分子在真核细胞中 具有胞内转运的生物学功能，且鸡Ii分子具有内体定位的作用。 关键词：鸡恒定链；GFP；真核表达 恒定链（invariant chain, Ii ）又称γ链，是MHC Ⅱ类分子的伴随分子，呈非多态性。Ii是 Ⅱ型膜糖蛋白，表达在巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞(APC)、B淋巴细胞、胸腺上 皮细胞和激活的T淋巴细胞等动物细胞表面[1] 。Ii在呈递外源性抗原过程中是重要的辅助分 子，其作用机理是通过其胞外部分对MHC Ⅱ类分子抗原结合位点起阻断作用、胞浆尾部提 供的MHC Ⅱ的Ii 复合体，经过分选、内化信号以及Ii 自身的初步降解，进而释放MHC Ⅱ类 [2] [3,4] 分子的信号 。由于mRNA 的可变剪接以及翻译起始点的差异，Ii 链可产生不同的异构体 , 如P31 、P41 、P35 和P43 ，而P31几乎存在于所有的抗原呈递细胞中[2] 。由于Ii 链引导MHC Ⅱ 类分子进入内体，所以具有内体定位功能。其内体分选信号由两个独立的的基元，即Ii 链 胞浆尾部的Leu 7/Ile 8和Pro 15/Met 16/ Leu 17 [130-134]组成。本研究小组在克隆鸡Ii基因时， 发现鸡的Ii异构体[4,5]，为了进一步研究鸡Ii分子在免疫调节中的功能及其机理，本研究通过 构建含鸡P31 的重组质粒N1-P31 、C1- P31，以及突变重组质粒C1-P8A、C1-P18A、C1-P8-18A， 以观察和探讨Ii 链的异构体P31在真核细胞中的表达特性及其内体定位功能。 1. 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 质粒、菌株与细胞 质粒DH5α 由本实验室保存，pEGFP-N1 和pEGFP-C1 为Invitrogen 公司产品，PMD18-T /Ii P31[4] 由本实验室构建。人293 细胞由安徽医科大学免疫学实验室何金生教授惠赠。 1.1.2 工具酶及试剂 dNTP、Taq 酶购自上海生工生物公司；质粒纯化试剂盒、DNA 清洁/PCR 产物清洁试剂 盒、DNA 提取试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司；琼脂糖（西班牙）；λDNA/ EcoR Ⅰ+Sal Ⅰ、EB 、卡纳霉素购自华美生物工程有限公司；DNA Marker DL2000 、限制性 1本课题得到国家自然科学基金:恒定链的点突变对融合基因的表达、定位及其免疫应答的影响(编号： 的资助。 - 1 - 内切酶（包括EcoR Ⅰ+Sal Ⅰ）和T4 连