实验一人类基因组DNA的提取与鉴定_百替生物.pdfVIP

实验一 人类基因组DNA 的提取与鉴定 实验目的 1、学习人类基因组DNA 的提取原理和方法。 2 、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。 实验原理 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备 DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的 材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为 了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。根据材料来源不同， 采取不同的材料处理方法，而后的 DNA 提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制 DNase 对DNA 的降解；（2 ）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏，保持DNA 分子的完整；（3）将 蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。 制备基因组 DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于 100-200kb 。在DNA 提取过程中应尽量避免使DNA 断裂和降解的各种因素，以保证DNA 的完整性， 7-9bp ，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保 为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA 有 10 存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA 以及SDS 等试剂存在下用蛋白酶K 消化细胞，随后用酚抽 提而实现的。这一方法获得的DNA 不仅经酶切后可用于Southern 分析，还可用于PCR 的模板、文库 构建等实验。 一、材料 一份提取总DNA 的细胞或组织 1.5ml Eppendorf 管、微量移液器与吸头、15ml 离心管、三角瓶（500 或1000ml）。 二、设备 离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸 水浴、透射紫外灯。 三、试剂 service@100 1．细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl ，1mmol/L EDTA 2 ．0.8% （W/V ）标准琼脂糖； 3 ．0.5×TBE 缓冲液 4 ．其他试剂：TE 缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲 液、溴化乙锭（EB ） 四、操作步骤 （酚法抽提染色体DNA） （一）DNA 的提取 1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将 唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm 离心10 分钟，倒掉上清；重复1 次。 2. 沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，混匀，再加350ml STE 和150ml 10% SDS，摇匀，至出现粘 稠透明状。加10ml 20mg/ml 蛋白酶K ，摇匀。37℃温箱过夜或50℃ 3~4 小时。 3 ．加等体积饱和酚，轻摇混匀10 分钟，室温2000rpm 离心10 分钟，去除蛋白和SDS 的沉淀。 4. 小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀5 分钟，室温2000rpm 离心5 分钟。 5. 小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。 6. 将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向 DNA 溶液中加入2.5 倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心 管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA 。用移液器吸头挑出DNA 沉淀，在新配制的70%乙醇洗二 次，室温干燥5 分钟，再将DNA 溶于20-100ml TE 中，测OD 值。 7. TE 溶解的DNA ，在4 ℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2 倍体积无水乙醇置-70℃保存。 （二）DNA 的鉴定及定量 1. 比色法: DNA 在260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm 处有最大的吸收峰，盐和小分子则集 中在230nm 处。因此，可以用260nm 波长进行分光测定DNA 浓度，OD 值为 1 相当于大约50μg/ml service@100 双链DNA 。如用1cm 光径，用 H O 稀释DNA 样品n 倍并以H O 为空白对照，根据此时读出的OD 2 2 260 值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA （mg/ml ）