半夏块茎高质量总RNA提取的一种有效方法.pdfVIP

第33卷第15期 中国中药杂志 V01．33．Is哪e15 2008年8月 of Memca AuglIst，2∞8 Cm衄JounImChine∞Materia 半夏块茎高质量总RNA提取的一种有效方法 黄月琴1’2，徐有明2，薛建平1’3+ (1．淮北煤炭师范学院生命科学学院，安徽淮北235000； 2．华中农业大学园艺林学学院，湖北武汉430cr70； 3．资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽淮北235000) [摘要】 目的：探讨一种有效提取半夏块茎总RNA方法。方法：以半夏试管苗的叶片、叶柄和块茎为试验材 料，将常规的异硫氰酸胍提取植物总RNA的方法做了改进，在RNA提取缓冲液中加入高浓度的口-巯基乙醇以除 。 去酚类物质，用酸酚／氯仿抽提去除蛋白质污染，以及利用异丙醇和醋酸钠联合沉淀多糖等手段，建立了一种简单 实用的从富含多酚类和多糖等物质的植物材料中提取总砌她的方法。结果：该方法所提RNA的月狮／A瑚均大于 有很高的质量和纯度，且得率很高，完全满足后续的DDRT·PcR和反向Nonhemblotting等分子生物学研究，而且简 单经济、实验结果稳定，重复性好，适合富含多酚类和多糖等物质的药用植物组织总RNA的提取。 [关键词]半夏；试管块茎；多酚类物质；多糖；总RNA；提取 282．5 【中图分类号]R [文献标识码】A[文章编号]1001-5302(2008)15-18lOJD4 植物组织RNA的提取是进行植物分子生物学 改进了常规的异硫氰酸胍法，通过在RNA提取缓冲 方面研究的必要前提。要进行RT-PCR，cDNA合液中加入高浓度的口一巯基乙醇，以及利用异丙醇和 成、RNA序列分析、No汕em印迹杂交、狭线杂交、引醋酸钠联合沉淀多糖等手段，从半夏试管小块茎中 物延伸，以及用mRNA差异显示技术筛选感兴趣的 相关基因等分子生物学研究，均需要有高质量、高纯 应中检验了其完整性好，能够满足mRNA差异显示 度、完整性好的RNA。可以说，分子生物学研究后 实验，为今后利用分子生物学手段研究半夏资源提 续工作的进展及成效在很大程度上取决于RNA的 供技术参考。 质量。所以，如何提高RNA纯度和经济而快捷地获 1材料 得足够量的RNA是当前研究人员十分关注的问题。 半夏材料由资源植物生物学安徽省重点实验室 植物组织RNA的提取最常用的方法是异硫氰酸胍 提供，经薛建平教授鉴定为天南星科三叶半夏 法，但半夏块茎富含多糖及酚类物质…，由于酚类 R，le胁口钯眺抛Breit．的试管苗和试管微型块茎。 化合物的存在，RNA提取过程中极易产生褐化效 2方法 2．1常规提取方法∞J 应【2J，氧化的酚类化合物(如醌类)可以与RNA不 可逆地结合，导致RNA的降解及RNA活性的丧 异硫氰酸胍法：取2g半夏组织，置于预先在冰 m01． 失【3J。多糖能与RNA共沉淀形成难溶的胶状物，还中冷冻的匀浆器中，加入4mL提取缓冲液(4 可以抑制许多酶的活性HJ。因此，针对半夏块茎富 L_1异硫氰酸胍，pH7．0的25咖01．L。1柠檬酸钠， 含多糖及酚类物质的特性，本实验对文献中植物组 0．5％十二烷基肌氨酸钠，O．1％口一巯基乙醇)后迅 织RNA提取技术进行尝试和分析∞引，在此基础上 速匀浆lnlin；加入加0灿2Inol·L_l醋酸钠，再加 人4 ccl万r·lIlin“离心20 烈混匀，4