PXR激活在拮抗SH-SY5Y细胞凋亡中的作用.pdfVIP

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(2): 149−153 研究简报 PXR 激活在拮抗SH-SY5Y 细胞凋亡中的作用 孟　春 　贾振华　陈　俊　熊玉林　王　航　李　锋　郭养浩* (福州大学生物科学与工程学院, 福州350108) 关键词　　PXR 激活; SH-SY5Y 细胞; 细胞凋亡; G /G 期阻滞 0 1 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞可以表达神 养物中加入终浓度为10 μg/μl 的罗丹明123, 避光孵 经元特异性的酪氨酸羟化酶、多巴胺-β- 羟化酶以 育30 min, 去除罗丹明染液, 预冷的PBS 洗涤三次, 及多巴胺转运体等[1,2], 因此可用于建立帕金森病的体 使用荧光显微镜镜检。激发波长为470 nm~490 nm, 外模型。虽然帕金森综合症发病的确切机制至今尚 发射波长为515 nm~565 nm 。细胞凋亡后期检测采 不清楚, 但众多的病理学资料证实该病患者存在中脑 用Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(流式细 黑质多巴胺能神经元的凋亡[3,4] 。自由基、兴奋性 胞仪), 具体步骤根据试剂盒说明书进行。 氨基酸、线粒体功能障碍等多种诱导细胞凋亡的因 细胞周期检测: 分别采用流式细胞仪(COULTER 素都可导致中脑黑质多巴胺能神经元死亡, 细胞凋亡 EPICS XL 流式细胞仪)检测。流式检测细胞周期根据 可能是帕金森病细胞死亡的主要方式[5] 。 试剂盒提供的程序进行。取对数生长期细胞, PBS 洗 孕烷X受体(PXR), 是配体依赖性转录因子核受 2 次, 70%(预冷) 乙醇固定, PBS 清洗后, 加入50 μg/ml 体(NR)家族的成员之一, 是药物代谢的关键转录调控 溴化乙锭, 100 μg/ml RNase A, 0.2% Triton X-100, 4℃ 因子, 能够响应许多临床药物的代谢。PXR 配基种 避光孵育30 分钟, 用300 目(孔径40~50 微米)尼龙网 类繁多, 包括内源性和外源性的许多化合物。当 过滤, 上机检测。 PXR 被配基激活后, 与视黄醇X 受体(RXR) 结合形 统计学分析: 采用SPSS 10.0 软件进行统计学 成异源二聚体, 作用于靶基因调控序列, 参与目标基 分析, 组间差异比较采用t 检验分析, 当P0.05 时为 [6] 。本工作初步研究发现神经母细胞 差异有统计学意义, P0.01 具有显著性差异。 因表达的调控 瘤细胞SH-SY5Y表达一定水平的PXR, 通过激活PXR 可进一步影响神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 的活性。 SH-SY5Y细胞中PXR表达水平及功能的检测 PXRi-HepG2 细胞株的构建: 寡核苷酸序列5’- 利福平是药物代谢酶CYP3A4 的诱导剂, 对肝脏 AAA UGG GAG AAG GUA GUG UCA AAA G-3’ 以及小肠中的CYP3A4 的表达有很大的诱导作用, 但 (siRNA-76) 由上海生工合成, 转染试剂为Lipofecta- 在SH-SY5Y 细胞中, PXR 表达及对CYP3A4 诱导表 mineTM 2000 (Invitrogen) 。HepG2 细胞的具体转 达情况还不清楚。我们通过添加利福平等药物刺激 染程序参照转染试剂说明书。 细胞48 h 后, 检测SH-SY5Y 细胞中PXR 及CYP3A4 目标产物半定量Real-PCR 检测: 根据Genbank 的表达。结果发现, PXR 在SH-SY5Y 细胞中存在一 数据库中人类PXR 、CYP3A4 、Actin