用限制性内切酶诱导染色体显带的分析AnalysisoftheChromosomeBandingwithRestricitonEndo.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)15(5):39-421993 ·综 述 · 用限制性内切酶诱导染色体显带的分析 刘 林 北（京农业大学畜牧系，100094) AnalysisoftheChromosomeBandingwithRestrictionEndonucleases Liu Lin (DepartmentofAnimalScience,BeijingAgriculturalUniversity,Beijing100094) 用某些Re：消化原位固定的中期染色休，染色体染色深度总体降低，对于某一种酶显示出特征性带型 2（3) 这一新发现，为更精细地分析染色体结构和功能等提供了新的方法．虽然有人对Res诱导显带的机制已作了一些 假设 “,22,2)，但对于固定的染色体，很难从本质上分析酶诱导其显带发生的生化变化，并很难确定这些带是如何 与染色体区域的组成相关联．近年来又发现Res也能诱导体外分离的、未固定的染色体显带(10,1)1．休外消化适 合于生化研究，可了解引起染色体显带的分子组成和构象．本文将对Res显带带型种类、显带方法、显带机制及 电镜下Res显带观察作一概述． 一 Res显带类型 Res可诱导C,G,NOR,R显带及某种酶特异带型．有些Res还可诱导出现染色体间隙．一般将限制性 内切酶显带记为R。显带 ，（〕，诱导显带的带型写在符号Re’后的括号内，带型名称后在括号内写上显带醉的名 称．例如，AM 诱导C显带，可记为：Re(C)(AluI）显带． 二、Res显带方法 1．原位固定的染色体Re。显带法 ，（， 先用空气干燥法制备染色体玻片标本；将反应液3（0活力单位Res溶于20 川特定缓冲液中）滴加到染色体标 本玻片上，小心地用盖玻片覆盖，防止气饱产生，然后将玻片置于湿润空气温箱中，37C1温育2小时或更长时间，移 去盖玻片，Giemsa染色，镜检．用特定缓冲液作空白对照不（显带）．应了解Res活性，以确定酶消化适宜的浓度和 时间． 2．分离的染色体体外Re。显带法 10〔,1)1 (1)细胞培养 在5:3:2的Hanks:199：马血清的混合培养液中，细胞长成单层；用过量的脱氧胸昔终（浓度 10mmol/L)处理24小时，可获得对数生长的同步化细胞；用Hanks液冲洗后，换新鲜培养液培养；8小时后，加人 秋水仙胺(0（.075ug/ml)继续过夜培养． (2)染色休的分离 从培养单层上收集积累的有丝分裂细胞，用Hanks 液冲洗后，离心 4（808)5分钟，再在 1:1Hanks:蒸馏水中悬浮 20分钟 冰（中），同上离心，然后用冷的 PMH(O.lmmol/LPipes缓冲液，Immol/LMgC12,Imol/L己糖，pH6.5）冲洗，离心1（0008)5分钟，再在lOml PMH中悬浮，371r温育10分钟；接着用22号针头注射器灌洗，以释放出染色体，可用相差显徽镜观察．未破裂细 胞以3008离心 10分钟使细胞团沉淀，将悬浮液再离心 1（5008)30分钟，收集染色体团．用少量PMH重浮染色体， 4t贮存． (3）内切酶消化 贮存在PMH中的染色休以15008离心30分钟，向沉淀物中加人特定酶消化缓冲 39 · 液使之重新悬浮，使染色休DNA终浓度达300u,g/ml．然后加入适当浓度的内切酶，置37C温育；不同时间取出 染色体悬液，每一样品中加EDTA（终浓度为IOmmol/L),lil冰上冷却，冰箱中过夜，以便染色质游离出来；1500g 离心30分钟，小心地将含有游离出的染色质悬液取出，贮存；再用含10mmol/LEDTA的消化缓冲液重新悬浮留 下的染色体团块．反复多次后，在相差显微镜下观察，以确保在悬液中无染色体． (4)将经消化的染色体部分及游 离出的染色体部分离心 1（500g,15分钟）到一盖玻片上，然后用 1:3的冰乙酸：甲醇固定，Giemsa染色． 三、Res显